• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
• /
• 제10권6호
• /
• pp.482-493
• /
• 2005

Biomass is originally photosynthesized from inorgainic compounds such as $CO_2$, minerals, water and solar energy. Recent studies have shown that anaerobic bacteria have the ability to convert recalcitrant biomass such as cellullosic or chitinoic materials to useful compounds. The biomass containing agricultural waste, unutilized wood and other garbage is expected to utilize as feed, food and fuel by microbial degradation and other metabolic functions. In this study we isolated several anaerobic, cellulolytic and chitinolytic bacteria from rumen fluid, compost and soil to study their related enzymes and genes. The anaerobic and cellulolytic bacteria, Clostridium thermocellum, Clostridium stercorarium, and Clostridium josui, were isolated from compost and the chitinolytic Clostridium paraputrificum from beach soil and Ruminococcus albus was isolated from cow rumen. After isolation, novel cellulase and xylanase genes from these anaerobes were cloned and expressed in Escherichia coli. The properties of the cloned enzymes showed that some of them were the components of the enzyme (cellulase) complex, i.e., cellulosome, which is known to form complexes by binding cohesin domains on the cellulase integrating protein (Cip: or core protein) and dockerin domains on the enzymes. Several dockerin and cohesin polypeptides were independently produced by E. coli and their binding properties were specified with BIAcore by measuring surface plasmon resonance. Three pairs of cohesin-dockerin with differing binding specificities were selected. Two of their genes encoding their respective cohesin polypeptides were combined to one gene and expressed in E. coli as a chimeric core protein, on which two dockerin-dehydrogenase chimeras, the dockerin-formaldehyde dehydrogenase and the dockerin-NADH dehydrogenase are planning to bind for catalyzing $CO_2$ reduction to formic acid by feeding NADH. This reaction may represent a novel strategy for the reduction of the green house gases. Enzymes from the anaerobes were also expressed in tobacco and rice plants. The activity of a xylanase from C. stercorarium was detected in leaves, stems, and rice grain under the control of CaMV35S promoter. The digestibility of transgenic rice leaves in goat rumen was slightly accelerated. C. paraputrificum was found to solubilize shrimp shells and chitin to generate hydrogen gas. Hydrogen productivity (1.7 mol $H_2/mol$ glucos) of the organism was improved up to 1.8 times by additional expression of the own hydrogenase gene in C. paraputrficum using a modified vector of Clostridiu, perfringens. The hydrygen producing microflora from soil, garbage and dried pelletted garbage, known as refuse derived fuel(RDF), were also found to be effective in converting biomass waste to hydrogen gas.

• The Plant Pathology Journal
• /
• 제25권4호
• /
• pp.344-351
• /
• 2009

A biocontrol bacterium Bacillus licheniformis N1 grown in nutrient broth showed no chitinolytic activity, while its genome contains a gene which encodes a chitinase. The gene for chitinase from B. licheniformis N1 was amplified by PCR and the deduced amino acid sequence analysis revealed that the chitinase exhibited over 95% identity with chitinases from other B. licheniformis strains. Escherichia coli cells carrying the recombinant plasmid displayed chitinase activity as revealed by the formation of a clear zone on chitin containing media, indicating that the gene could be expressed in E. coli cells. Chitinase gene expression in B. licheniformis N1 was not detected by RT-PCR analysis. The protein was over-expressed in E. coli BL21 (DE3) as a glutathione S-transferase fusion protein. The protein could also be produced in B. subtilis 168 strain carrying the chitinase gene of N1 strain. The crude protein extract from E. coli BL21 carrying GST fusion protein or culture supernatant of B. subtilis carrying the chitinase gene exhibited enzyme activity by hydrolyzing chitin analogs, 4-methylumbelliferyl-$\beta$-D-N,N'-diacetylchitobioside and 4-methylumbelliferyl-$\beta$-D-N,N',N"-triacetylchitotrioside. These results indicated that even though the chitinase gene is not expressed in the N1 strain, the coding region is functional and encodes an active chitinase enzyme. Furthermore, B. subtilis 168 transformants expressing the chitinase gene exhibited antifungal activity against Fulvia fulva by suppressing spore germination. Our results suggest that the proper engineering of the expression of the indigenous chitinase gene, which will lead to its expression in the biocontrol strain B. licheniformis N1, may further enhance its biocontrol activity.

• 한국잠사곤충학회지
• /
• 제39권2호
• /
• pp.161-168
• /
• 1997

To clarify the effect of anti-juvenile hormone analogue (AJH) on the larval ecdysis by feeding at early stage of the 4th instar, the total amount of protein and activity of chitinolytic enzymes in the integument of Bombyx mori were analyzed, PAGE pattern of the protein was observed and the morphological changes of integument during molting period were also observed and the morphological changes of integument during molting period were also observed by means of TEM. The total amount of protein was greatly increased in premolting, then reached maximum level just before ecdysis, and rapidly decreased after the larval ecdysis in the control, while in the AJH treatment, increased 12 hr later than the control and its maximum was only 82.6% of the control. Two specific proteins, which were presumed as the protein originated from endocuticle, also appeared 12 hr later than the control and were maintained to 132 hr after AJH treatment from the aspects of the Native- and SDS-PAGE patterns, although those of the control disappeared instantly after ecdysis. Chitinase and $\beta$-N-acetylglucosaminidase activities were also suppressed and delayed by AJH treatment. Furthermore, it was observed that the apolysis took place 12 hr later than the control but new epicuticle was not formed at least until 132 hr after AJH treatment. From these results, it is suggested that the larval molting process of silkworm develops 12 hr later than the control but new epicuticle was not formed at least until 132 hr after AJH treatment. From these results, it is suggested that the larval molting process of silkworm develops 12 hr later than the control by AJH treatment but no further processing takes place just after apolysis.

• 한국해양생명과학회지
• /
• 제8권1호
• /
• pp.56-67
• /
• 2023

Marine macroalgae are important in coastal ecosystems and interact with marine microorganisms. In this study, we isolated fungi from seven types of marine macroalgae including Cladophora sp., Gloiopeltis furcate, Gracilariopsis chorda, Hydroclathrus clathratus, Prionitis crispata, Sargassum micracanthum, and Ulva lactuca collected in Korea. Morphological and phylogenetic analyses identified the isolates as four Aspergillus spp. (A. fumigatus, A. sydowii, A. tamarii, and A. terreus), three Penicillium spp. (P. crustosum, P. jejuense, and P. rubens), and Cladosporium tenuissimum. Among them, A. fumigatus TOP-U2, A. tamarii SH-Sw5, and A. terreus GJ-Gf2 strains showed the activities of all enzymes examined (amylase, chitinase, lipase, and protease). Based on the enzymatic index (EI) values in solid media, A. terreus GJ-Gf2 and C. tenuissimum UL-Pr1 exhibited the highest amylase and lipase activities, respectively. Chitinolytic activity was only observed in A. terreus GJ-Gf2, A. tamarii SH-Sw5, and A. fumigatus TOP-U2. Penicillium crustosum UL-Cl2 and C. tenuissimum UL-Pr1 showed the highest protease activities. To the best of our knowledge, this is the first report of lipolytic and proteolytic activities in a marine-derived C. tenuissimum strain. Overall, the fungal strains isolated from the marine macroalgae in this study actively produced industrially important enzymes.

• 한국토양비료학회지
• /
• 제43권4호
• /
• pp.490-497
• /
• 2010

근권토양으로부터 고추역병균을 포함한 다양한 식물 병원성 곰팡이에 대하여 항균활성이 강한 세균을 분리하였다. 이 세균은 16S rRNA gene서열 분석 결과 Lysobacter enzymogens로 동정되었고 LE429로 명명 하였다. LE429는 chitinase, ${\beta}-1$, 3-glucanase, protease, gelatinase, lipase 및 항생물질과 같은 다양한 이차대사산물을 분비하였다. 항생물질은 diaon HP-20 및 sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피 및 HPLC로 정제하여, GC-EI 및 GC-CI분석을 통하여 phenylacetic acid로 동정되었다. Field 실험에서 LE429의 고추 병해 억제 효과를 조사하기 위해 LE429배양액(CB), Neem oil 용액 (NO), LE429배양액과 Neem oil 용액을 섞은 혼합액(CB+NO), 그리고 대조구로서 물(CON)을 각각 고추에 처리하였다. 고추의 수량구성요소는 일반적으로 CB 처리구가 가장 높았고, CB+NO, CON 그리고 NO 순서로 나타났다. CB 처리구에서 병원성 곰팡이는 강하게 억제 되었지만, 몇몇 해충이 발견되었다. NO 처리구에서는 해충은 발견 되지 않았지만, 병원성 곰팡이가 발견 되었다. 하지만, CB+NO 처리구에서 병원성 곰팡이 및 해충이 전혀 발견 되지 않았다. 결론적으로, 2차 대 사산물을 생산하는 LE429와 Neem oil의 혼합액은 고추에 발생하는 병원성 곰팡이와 해충에 대한 좋은 생물학적 방제제가 될 수 있다고 사료된다.

• 미생물학회지
• /
• 제48권4호
• /
• pp.293-297
• /
• 2012

극지의 다양한 환경으로부터 분리되어 극지연구소 PAMC(Polar and Alpine Microbial Collection)에 보관중인 169개 균주들을 0.4% colloidal chitin이 첨가된 ZoBell 고체배지에서 배양하여 chitinase 활성을 균주 27개를 선별하였다. 그 중 PAMC 21693 균주는 저온에서 pNP-$(GlcNAc)_1$를 기질로 사용했을 때 가장 큰 활성을 보였고, $4-37^{\circ}C$의 온도 범위 중 $4^{\circ}C$에서 가장 높은 개체수 증가율을 보였다. PAMC 21693의 chitinase 유전자를 클로닝한 결과 2,619 bp의 ORF를 포함하는 총 2,857 bp의 염기서열을 확보하였다. 대장균에서 chitinase 유전자의 재조합 단백질을 발현한 결과 분자량 96 kDa의 재조합 단백질을 확인할 수 있었다. 본 논문에서는 극지 미생물 유래 저온활성 chitinase들의 생물공학 분야에서의 이용가능성을 제시하였다.

• 한국토양비료학회지
• /
• 제39권1호
• /
• pp.15-20
• /
• 2006

최근 들어서 생물학적 제어 방법의 하나로써 키틴분해 미생물을 이용한 제어 수단이 식물병제어에 일정한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. Fusarium 시들음병을 억제하기 위하여 40kg의 키틴퇴비를 면적이 $7.5m^2$ 인 토양에 정식 7일전 처리하였으며 토마토가 시들음병 증세를 보이기 시작하는 날(정식 후 66일)로부터 시작하여 4번에 걸쳐 시료를 채취하였다. 키틴퇴비 처리구(CTC)의 근권토양의 키틴효소와 ${\beta}$-1,3-glucan 효소 활성은 일반퇴비 처리구 (CC) 토양 보다 항상 높은 값을 나타냈다. 그러나 식물체 뿌리에서 측정된 chitinase, ${\beta}$-1,3-glucanase, peroxidase과 같은 병 관련 효소들은 CNC에서 실험기간동안 증가 추이를 보였다. 실험의 마지막 단계인 정식 후 96일째에는 CTC의 토마토는 CC 와 비교 할 때 25% 낮은 치사율을 나타냈다.

• 한국토양비료학회지
• /
• 제39권4호
• /
• pp.185-194
• /
• 2006

몇 년동안 게껍질이 풍부하게 있었던 밭토양에서 강한 키틴분해능력을 가진 Trichoderma 곰팡이를 분리하였다. 분리된 곰팡이의 5.8S rRNA, partial 18S, 28S rRNA genes, ITS1, ITS2 sequence 분석과 형태학적 특징을 살펴본 결과 Trichoderma asperellum으로 동정되었고, 이를 Trichoderma asperellum T-5 (TaT-5)로 명명하였다. 이 곰팡이는 chitianse와 ${\beta}$-1,3-glucanase같은 lytic enzyme을 분비하며, 키틴배지 상에서 6가지의 항 곰팡이성 물질을 생산했다. R. solani가 원인인 오이의 모잘록병에 대해 TaT 5의 방제효과를 보기 위해서 TaT-5 배양액(TA), chitin medium(CM), 증류수(DW)를 씨를 심은 후 10일 째에 각 pot에 관주했다. 그리고 관주 1주일 후에 R. solani의 균사를 갈아서 각 pot에 주었다. 실험기간 동안에 오이의 지상부와 지하부 생체중은 다른 처리구에 비하여 TA 처리구가 더 많이 증가하였다. 오이 잎에서 PR-protein (chitianse, ${\beta}$-1,3-glucanase) 활성은 R. solani 감염 후 CM과 DW에서 증가를 보였고, TA 처리구에서는 증가하다가 감소하는 경향을 보였다. 뿌리에서는 모든 처리구가 감소하는 경향을 보였지만 TA 처리구가 CM과 DW 처리구보다 감소하는 정도가 적었다. 오이의 잎과 뿌리에서 lignification related enzyme(POD, PPO, PAL)활성은 R. solani 감염 초기에는 증가하다가 점점 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과들은 TaT-5에 의하여 생산된 lytic enzymes와 항 곰팡이성 물질들이 오이에 R. solani의 공격을 줄여준다고 생각된다.

• 한국토양비료학회지
• /
• 제44권6호
• /
• pp.1150-1157
• /
• 2011

친환경 뿌리혹선충 방제제로써의 활용을 위해 전남 무안 해안가 토양으로부터 chitin 및 gelatin 분해활성이 있는 Streptomyces sampsonii KK1024를 분리하였다. KK1024는 키틴분해효소, 단백질분해효소, 젤라틴분해효소 및 지질분해효소 활성이 있음이 조사되었다. KK1024의 뿌리혹선충 유충 치사 및 알 부화 억제 효과를 조사한 결과, 배양액 50% 처리 시 유충 치사율이 3일째 81%, 알 부화율이 5일째 2%로 나타났다. 또한, 조효소 $183.7{\mu}g\;mL^{-1}$ 처리 시 유충 치사율이 3일째 96%, 알 부화율이 5일째 5%를 나타냈다. 부탄올 추출물질 1% 처리 시 3일째 유충 치사율이 90%, 알 부화율이 0%로 나타났다. 미생물 배양액이 선충 피해 방제와 식물생장에 미치는 영향을 조사해 본 결과, 식물 지상부 무게 및 크기에서 미생물 배양액 처리구가 배지, 비료, 농약처리구 보다 높게 나타났다. 선충 피해 방제에 있어서 미생물 배양액 처리구가 난낭 수, 뿌리혹 수, 토양 내 유충 수에서 농약 처리구 보다는 높게 나타났지만, 배지 및 비료 처리구 보다는 낮게 나타났다. 이러한 결과로 보아 다양한 분해효소 및 살선충 물질을 생성하는 Streptomyces sampsonii KK1024는 뿌리혹선충을 생물학적으로 방제할 수 있는 방제제로서 가치가 있다고 사료된다.