• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제23권3호
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• pp.304-312
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• 2013

The thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha is attracting interest as a potential strain for the production of recombinant proteins and biofuels. However, only limited numbers of genome engineering tools are currently available for H. polymorpha. In the present study, we identified the HpPOL3 gene encoding the catalytic subunit of DNA polymerase ${\delta}$ of H. polymorpha and mutated the sequence encoding conserved amino acid residues that are important for its proofreading 3'${\rightarrow}$5' exonuclease activity. The resulting $HpPOL3^*$ gene encoding the error-prone proofreading-deficient DNA polymerase ${\delta}$ was cloned under a methanol oxidase promoter to construct the mutator plasmid pHIF8, which also contains additional elements for site-specific chromosomal integration, selection, and excision. In a H. polymorpha mutator strain chromosomally integrated with pHIF8, a $URA3^-$ mutant resistant to 5-fluoroorotic acid was generated at a 50-fold higher frequency than in the wild-type strain, due to the dominant negative expression of $HpPOL3^*$. Moreover, after obtaining the desired mutant, the mutator allele was readily removed from the chromosome by homologous recombination to avoid the uncontrolled accumulation of additional mutations. Our mutator system, which depends on the accumulation of random mutations that are incorporated during DNA replication, will be useful to generate strains with mutant phenotypes, especially those related to unknown or multiple genes on the chromosome.

• 공업화학
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• 제27권2호
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• pp.171-178
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• 2016

세계 각국은 석유자원의 고갈로 인한 고유가, 지구온난화 등의 환경문제를 해결하기 위하여 많은 노력을 하고 있다. 그중 기존 화석연료를 대체할 수 있는 재생 가능한 청정 에너지원으로 바이오 연료가 주목받고 있다. 그러나 기존의 바이오연료 생산기술은 식량자원인 사탕수수, 옥수수 등을 사용하므로 이를 대체하는 기술개발이 요구되고 있다. 이에 본 연구에서는 식량자원을 대체할 폐기물의 가스화와 혼합 알코올 합성공정이 연계된 간접 알코올 전환 공정의 기술 경제성 평가를 수행하였다. 국내에서 공급되는 바이오매스 폐기물 자원량을 고려한 2000톤/일 급의 전환 공정에서 매일 533000 L의 연료용 에탄올을 생산한다고 가정하였고 이를 위해 필요한 경제성 자료는 기발표된 자료들로부터 계산되어 경제성 분석에 이용되었다. 경제성 분석은 원금회수기간과 내부수익률(internal rate of return, IRR) 및 순현재가치(Net Present Value, NPV)로 진행되었으며, 원료비용과 초기 투자비, 주요 공정비용 및 에탄올 가격 변화, 운용비용의 민감도 분석을 진행하여 각 항목별 민감도를 고찰하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권7호
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• pp.1035-1043
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• 2021

Although engineered Saccharomyces cerevisiae fermenting cellobiose is useful for the production of biofuels from cellulosic biomass, cellodextrin accumulation is one of the main problems reducing ethanol yield and productivity in cellobiose fermentation with S. cerevisiae expressing cellodextrin transporter (CDT) and intracellular β-glucosidase (GH1-1). In this study, we investigated the reason for the cellodextrin accumulation and how to alleviate its formation during cellobiose fermentation using engineered S. cerevisiae fermenting cellobiose. From the series of cellobiose fermentation using S. cerevisiae expressing only GH1-1 under several culture conditions, it was discovered that small amounts of GH1-1 were secreted and cellodextrin was generated through trans-glycosylation activity of the secreted GH1-1. As GH1-1 does not have a secretion signal peptide, non-conventional protein secretion might facilitate the secretion of GH1-1. In cellobiose fermentations with S. cerevisiae expressing only GH1-1, knockout of TLG2 gene involved in non-conventional protein secretion pathway significantly delayed cellodextrin formation by reducing the secretion of GH1-1 by more than 50%. However, in cellobiose fermentations with S. cerevisiae expressing both GH1-1 and CDT-1, TLG2 knockout did not show a significant effect on cellodextrin formation, although secretion of GH1-1 was reduced by more than 40%. These results suggest that the development of new intracellular β-glucosidase, not influenced by non-conventional protein secretion, is required for better cellobiose fermentation performances of engineered S. cerevisiae fermenting cellobiose.

• 생명과학회지
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• 제32권8호
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• pp.659-665
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• 2022

Chlorella vulgaris는 인간과 동물에서 주요한 식품의 원료로 이용되는 수 조류이다. 최근 클로렐라는 어류 양식, 생물연료 및 영양물질과 치료용 단백질의 생산을 위한 이용 가능성과 관련하여 많은 관심을 받고 있다. 최근 본 연구실에서는 빠른 성장, 배양의 용이성, 암 조건에서의 배양성을 특징으로 하는 새로운 C. vulgaris PKVL7422균주를 분리하였으나, 이 균주의 질소 이용에 관련된 유전자에 대하여는 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 cDNA 말단의 신속 증폭과 genome walking을 이용하여 C. vulgaris PKVL7422의 질산환원 효소(nitrate reductase, NR)를 동정하였다. C. vulgaris PKVL7422 NR 유전자는 약 8 kb이며, 18개의 인트론과 877개의 아미노산을 암호화 하는 19개의 엑손으로 되어 있다. 기존의 알려진 NR 단백질과의 비교 분석 결과 C. vulgaris PKVL7422 NR 단백질은 식물의 NR에 존재하는 5개의 도메인과 다수의 비변이성 아미노산 잔기를 가지고 있는 것으로 확인되었으며, 이러한 결과는 조류 NR 유전자의 분자생물학적 구조에 대한 새로운 정보를 제공한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제33권11호
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• pp.1403-1411
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• 2023

Carbon dioxide (CO₂) is the most abundant component of greenhouse gases (GHGs) and directly creates environmental issues such as global warming and climate change. Carbon capture and storage have been proposed mainly to solve the problem of increasing CO₂ concentration in the atmosphere; however, more emphasis has recently been placed on its use. Among the many methods of using CO₂, one of the key environmentally friendly technologies involves biologically converting CO₂ into other organic substances such as biofuels, chemicals, and biomass via various metabolic pathways. Although an efficient biocatalyst for industrial applications has not yet been developed, biological CO₂ conversion is the needed direction. To this end, this review briefly summarizes seven known natural CO₂ fixation pathways according to carbon number and describes recent studies in which natural CO₂ assimilation systems have been applied to heterogeneous in vivo and in vitro systems. In addition, studies on the production of methanol through the reduction of CO₂ are introduced. The importance of redox cofactors, which are often overlooked in the CO₂ assimilation reaction by enzymes, is presented; methods for their recycling are proposed. Although more research is needed, biological CO₂ conversion will play an important role in reducing GHG emissions and producing useful substances in terms of resource cycling.

• 한국응용과학기술학회지
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• 제34권3호
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• pp.683-693
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• 2017

지구 온난화, 석유 고갈, 환경 오염에 대한 방안으로 수송부문에서 국제적으로 바이오연료에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 그 중 바이오디젤은 이산화탄소 감소 효과와 인체에 무해하며 세탄가가 높아 석유디젤을 대체할 수 있는 장점을 가지고 있다. 현재 국내 바이오디젤 수요는 지속적으로 증가하고 있으나 원료부족으로 인해 수입의존도가 커지고 있는 상황이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 연구는 현재 사용되지 않는 음폐유(약 33 % 유리지방산 함유)를 Amberlyst-15촉매를 이용한 에스테르화 반응을 통해 바이오디젤 원료로서 활용가능성을 확인 하였다. 다양한 반응 조건의 영향을 조사하기 위한 실험을 수행한 결과 반응온도 383 K에서 97.62 %의 전환율을 얻었으며, 반응속도는 353 K에서 373 K로 증가 할 때 최대 1.99 배까지 상승하였다. 또한 동역학적 결과를 이용하여 29.75 kJ/mol의 활성화 에너지를 확인하여 선행연구에서 연구된 타 고체촉매에 비해 에스테르화반응에 Amberlyst-15 더 적합함을 확인하였다. 그리고 메탄올 몰 비가 증가함에 따라 최대 91.43 %의 반응 전환율을 확인하였고, 촉매량 영향의 경우 0 wt%에서 20 wt%까지 증가시킨 결과 반응 전환율이 43.78 %에서 94.62 %까지, 초기 반응 속도는 1.1~1.4 배로 상승하는 것을 확인하였다. 교반속도의 경우 100~900 rpm의 조건에 따라 실험을 수행하였으나 반응 전환율에는 큰 영향을 주지 않음을 확인하였고 반응 시간에 따른 영향의 경우 240 분 까지 산가 감소를 보이다가 300 분이 지나면서부터 산가가 상승하는 결과를 가져왔다. 그리고 위 실험들을 통해 도출된 최적 조건을 적용하여 음폐유 에스테르화 반응에 적용하였고 그 결과 반응시간 60 분에서 음폐유와 모사 폐유지간의 13 %의 반응 전환율 차이를 보였으나 최종 240 분 반응 전환율은 모사 폐유지 98.12 %, 음폐유는 97.62 %로 거의 유사한 결과를 얻었다.

• Korean Chemical Engineering Research
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• 제55권5호
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• pp.609-617
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• 2017

목질계 바이오매스는 바이오 연료 및 바이오 화학제품 생산을 위한 재생 가능 자원이다. 푸르푸랄(furfural, FF)은 목질계 바이오매스의 헤미셀룰로스로부터 화학적 촉매전환으로 유도되는 주요한 플랫폼 케미칼이다. 테트라히드로푸르푸릴 알코올(Tetrahydrofurfuryl alcohol, THFA)은 FF의 유도체로 열적 화학적 안정성을 지닌 친환경 용매로 이용 가능하다. FF를 THFA로 전환하는 실험적 연구가 다수 존재함에도 불구하고, FF로부터 THFA의 대량생산에 관한 경제적 실현가능성에 관한 연구는 거의 수행되지 않았다. 개발된 전환기술의 상용화 단계에서 기술적 병목점 확인과 스케일업 문제의 해결을 위한 정보를 얻기 위해 실증플랜트 규모의 연구가 필요하다. 본 연구에서는 FF의 THFA로의 화학적 촉매전환에 대해 공정 시뮬레이션 및 기술경제성 평가가 수행되며, 3가지 단계(통합 공정 디자인, 열 통합, 경제성 평가)를 거친다. 실험연구 결과를 기반으로 전환공정과 분리공정을 포함하는 실증플랜트 규모의 통합공정이 설계된다. FF 처리량은 일일 255톤이며, FF로부터 THFA로의 수율은 63.2~67.9 mol%이다. 통합공정에 대해 열 통합을 수행하여 가열요구량을 최초 대비 14.4~16.4% 감소시킬 수 있었다. 최종적으로 경제성 평가를 통해 전체 공정의 주요 비용원을 분석하고 THFA의 최소판매가격을 결정하였다. 개발된 공정에서 생산되는 THFA의 최소판매가격은 1톤당 2,120~2,340 달러로, 현재 THFA의 시장 가격에 근접한다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권3호
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• pp.319-326
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• 2010

화석에너지의 고갈과 지구 온난화 현상으로 인해 재생 가능한 식물자원으로부터 바이오에너지를 얻고자 하는 관심이 높아지고 있다. 이에 바이오디젤의 원료로 사용 되기 적합한 형질전환이 된 유채를 개발하기 위한 첫 단계로 한국 고유 유채 품종을 이용한 형질전환 체계를 구축하였다. 내한, 영산, 탐미, 한라 유채의 종자를 분양 받아 지방산 분석을 실시한 결과, 종자의 약 32-40% 식물성 오일이 포함되어 있었고, 그 중 올레인산의 함량은 60mole% 이상 존재하는 것으로 확인되었다. 그 중 오일 함량 및 올레인산 함량이 높고, 형질전환 효율이 비교적 높은 한라 유채품종이 그리고 $\beta$-glucuronidase (GUS)와 phosphinothricin acetyltransferase (PAT) 유전자가 포함된 pCAM-BIA3301 벡터가 도입된 Agrobacterium tumefaciens GV3101균주가 형질전환에 사용되었다. 형질전환이 된 유채 식물체는 제초제에 대한 내성, PCR을 이용한 PAT 유전자의 도입 여부 및 GUS 활성 분석을 통하여 선별하였다. 그 결과 한라 유채의 경우, 10. 4% 형질전환 효율을 보였고, 제초제 저항성이 다음 세대 ($T_1$ 식물체)로 안정되게 유전됨을 확인하였다. 이러한 연구는 바이오디젤 원료로 사용될 다양한 유채 품종에 교배를 통해 제초제 저항성 유전자를 쉽게 도입할 수 있는 가능성을 제시하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권3호
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• pp.400-407
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• 2016

인삼 유묘 뿌리 주변에서 자라고 있는 단세포 녹색 조류, 클로렐라 불가리스 KNUA027을 순수분리한 후 본 분리균주의 생물공학적 활용 가능성에대해조사를 실시하였다. 가스크로마토그래프/질량분석기를 이용한 분석 결과, 본 균주에는 영양학적으로 중요한 알파 리놀렌산(C_18:3 ω3, 45.8%, 50.8 mg/g) 및 헥사데카트리엔산(C_16:3 ω3, 11.8%, 13.1 mg/g)과 같은 다가불포화지방산이 풍부한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 국내 토착 미세조류는 잠재적인 오메가-3 다가불포화지방산 원료가 될 수 있다고 사료된다. 또한, 바이오디젤 생산에 적합한 것으로 알려져 있는 팔미트산(C_16:0, 37.1%, 41.2 mg/g) 역시 본 균주에 의해 주요 지방산 성분으로 생합성 되는 것으로 확인되었다. 근사분석 결과 KNUA027 균주의 휘발성물질 함량은 88.5%였으며, 원소분석 결과 고위발열량은 19.8 MJ/kg으로 나타났다. 본 KNUA027 균주를 이용한 연구결과는 미세조류 기반 바이오연료와 바이오매스 생산을 위한 기초자료 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제19권12호
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• pp.1836-1840
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• 2009

참깨의 뿌리를 바이오촉매로 이용한 뿌리 배양을 통하여 HMF를 생산하기 위하여 뿌리의 생장과 HMF의 합성에 적합한 뿌리배양 조건을 탐색하였으며, 이를 위하여 NAA(naphthalene acetic acid), silver nitrate의 적정 농도조건 및 적정 배양온도 조건에 대한 실험이 수행되었다. 뿌리의 생장이 가장 높은 처리구는 $30^{\circ}C$에서 NAA의 농도가 1.0 mg/l로 첨가된 처리구에서 측정되었으며, 평균적으로 볼 때 두 배양 온도($25^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$)간에는 뿌리의 생장차이는 측정되지 않았다. NAA가 첨가되지 않은 처리에서는 두 배양온도 모두에서 참깨의 뿌리생장이 전혀 생기지 않은 반면에, NAA가 첨가된 배양에서는 두 배양온도에서 뿌리의 생장이 확인되었다. 그리고 0.5 mg/l의 질산은이 첨가된 처리구에서 참깨의 뿌리생장이 가장 높게 측정되었으며, $25^{\circ}C$에서 배양된 처리구 보다는 $30^{\circ}C$에서 배양된 뿌리의 생장이 약간 높게 나타났고, 질산은의 농도가 0.5 mg/l 이상의 높은 농도에서는 뿌리의 생장이 오히려 감소되는 경향이 있었다. 그리고 HMF의 합성의 경우 가장 높게 측정된 처리구는 배양온도 $25^{\circ}C$에서 NAA 0.5 mg/l이 첨가된 처리구에서 측정된 반면에 NAA 무처리구에서는 HMF 합성이 측정되지 않았다. 질산은이 첨가된 처리구에서는 HMF의 합성이 오히려 억제되는 경향을 보여준 반면에 질산은의 무처리구에서 HMF의 합성이 가장 높은 결과가 나타났다. 질산은의 농도가 0.5, 1.0 및 1,5 mg/l로 처리된 구에서는 질산은 무처리구에 비해서 약 8-10% 정도의 HMF 합성이 감소되는 경향이 나타났으며, 두 배양 온도($25^{\circ}C$와 $30^{\circ}C$ 배양) 간에도 HMF의 합성에는 차이가 보이지 않았다.