• Applied Biological Chemistry
• /
• 제39권6호
• /
• pp.472-476
• /
• 1996

P.putida NCIMB 9869와 P. putida NCIMB 9866의 분해 plasmid pRA 4000과 pRA500으로부터 p-cresol mothylhydroxylase(PCMH)의 flavoprotein(pchF) 및 cytochrome(pCHC) subunit의 구조유전자를 sequencing하였다. 이 두개의 유전자의 DNA 및 아미노산의 염기 서열은 이미 발표를 하였다. 이 두 개의 유전자 이외에도 aldehyde dehydrogenase 유전자가 확인되었다. 이 aldehyde dehydrogenase는 p-hydroxybezaldehyde를 p-hydroxybenzonate로 전환시키는데 p-hydroxybezaldehyde는 P-cresol의 PCMH에 의한 분해 산물이다. 그 외에도 P. putida 9869의 protocatechuate 3,4-dioxigenase의 alpha(pcaG) 및 beta(pcaH) subunit 가 확인되었다. 반면에 P. putida 9866는 상응하는 영역에 이 유전자들을 가지고 있지 않았다(protocatechuate는 p-hydroxyben-zonate hydroxylase에 의해 p-hydroxybenzonate로부터 생성된다). pchC와 pchF사이에 open reading frame이 존재하며 9866로 부터는 추가로 다른 하나의 open reading frame (ORF')가 존재한다. 9869과 9866의 유전자 구조는 각각 dhal-pchC-ORF-pchF-pcaGH과 ORF'-dhal-pchC-ORF-pchF다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제30권1호
• /
• pp.8-14
• /
• 2002

Pseudomonas sp. S-47은 xylXYZLTE 유전자에 의하여 암호화되는 효소군에 의하여 4CBA를 분해하여 5-chloro-2-hydroxymuconic semialdehyde(5C-2HMS)를 생성하는데, 본 연구에서는 이 5C-2HMS의 다음 분해과정을 확인하였다. xylXYZLTE 유전자와 5-chloro-2-hydroxymuconic semialdehyde dehydrogenase(5C-2HMSD)를 암호화하고 xylG 유전자를 포함하는 재조합 균주인 pCSS202로부터, xylG 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pENV5를 만들었다. 이 플라스미드는 2-hydroxymuconic semialdehyde, 3-chloro-muconate, 2-hydroxy-6-oxohepta-2,4-dienoate, 2-hydroxy-5-methylmuconic semialdehyde와 같은 aromatic compound 에서 분해능을 나타냈으며, 그 중 5C-2HMS에서 가장 높은 분해능을 나타내었다. 또한 5C-2HMSD를 암호화하는 유전자인 xylC의 염기서열을 분석한 결과, 약 1,600 bp의 염기와 486개의 amino acid residue를 갖고있는 것을 확인하였다. P. sp. S-47의 xylG 유전자를 비교 분석한 결과 P. putida CF600, P. putida G7과 P. putida mt-2 등의 5C-2HMS dehydro-genase와 85％ 이상의 amino acid homology를 보여주었다.

• 미생물학회지
• /
• 제41권3호
• /
• pp.157-163
• /
• 2005

요각류 Paracyclopina nana Acetate Kinase를 클로닝하였다. 전체 open reading frame은 1,200 bp이었으며, poly(A) signal sequence가 ORF에 내재되어 있었다. 분자계통학적 분석결과 P. nana acetate kinase 유전자는 진핵생물계 곰팡이류인 Aspegillus와 같은 branch를 형성하였고, P. nana acetate kinase가 다른 원핵미생물들의 acetate kinase와는 구별되며 fungi와 같은 branch에 존재하는 것을 확인하였다. 또한, E. coli를 이용하여 원핵세포 발현벡터를 이용한 단백질 발현 유도를 통하여 P. nana acetate kinase 단백질 분자량이 약 50 kDa에 이르는 것을 확인하였다. 이 자료는 본 요각류와 다른 생물의 acetate kinase 단백질의 생화학적 특성비교에 유용하게 쓰이리라 사료된다.

• 대한의생명과학회지
• /
• 제6권3호
• /
• pp.165-170
• /
• 2000

Vacuolar (H$^{+}$)-ATPase (V-ATPase)는 multi-subunit로 구성된 단백질로서, proton pumping을 통해 세포내 산성화반응에 관여를 한다. 최근에 이 단백질이 synaptic vesicle에서도 발견된 것으로 보아 뇌 신경전달에 중요한 역할을 수행할 것으로 추정하고 있다. 우리는 흰쥐 뇌에서 분리한 mRNA를 주형으로 한 PCR 반응에서 16 kDa subunit의 V-ATPase cDHA를 클로닝할 수 있었고, 이의 염기서열 또한 결정하였다. 분리된 뇌 16 kDa V-ATPase의 coding sequence는 전체 468 bp로서 간에서 보고되었던 것과 동일한 크기였다. 단지 3' 말단의 염기 하나가 A에서 C로 바뀌어 있었는데 모두 alanine (GCA, GCC)을 지정하기 때문에 단백질의 일차구조에는 변화가 없는 것으로 확인되었다. 한편 rat brain cDNA library에서도 동일한 clone이 분리되었는데 역시 같은 부분에서 polymorphism이 발견되었고, RNA splicing 등 더 이상의 조직특이적 변화는 없었다. 본 연구는 16 kDa V-ATPase의 뇌에서의 기능과 신경말단에서의 neurotransmission 및 synaptic vesicle의 재순환 기전을 이해하는데 유용한 정보가 될 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제34권2호
• /
• pp.129-135
• /
• 2006

Zebrafish (Danio rerio)의 microsomal epoxide hydrolase(mEH)로 추정되는 유전자를 클로닝하고 그 특성을 연구하였다. D. rerio의 mEH 추정단백질은 포유동물의 mEH 및 세균의 EH들과 아미노산서열 상동성을 보였으므로 결정분자구조(1qo7 및 1ehy)를 template로 하여 homology modelling을 행하였다. 클로된 단백질은 $Asp^{233}$, $Glu^{413}$ 및 $His^{440}$으로 구성된 catalytic triad와 2개의 tyrosine 잔기 및 oxyanion hole이 보존되어 있었다. 생물정보학적인 분석 및 EH 활성시험은 추정단백질이 D. rerio의 mEH라는 것을 보여주었다. Racemic styrene oxide를 기질로 하여 활성시험을 행한 결과, 재조합 D. rerio mEH는 (R)-styrene oxide을 입체선택적으로 가수분해하였으며 45분 반응시간에 99%ee의 광학순도를 가진 (S)-styrene oxide를 33.5% 얻을 수 있었다.

• KSBB Journal
• /
• 제16권6호
• /
• pp.562-567
• /
• 2001

Styrene oxide 계열의 라세믹 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수분해능이 우수한 Aspergillus nigerr계열의 생촉매를 선발하였고, A.niger LK 유래의 EHase의 기질 특이성을 분석하였다. A. niger LK의 EHase는 benzene ring에 oxirane ring이 직접 연결되어 있는 styrene oxide, p-nitrostyrene oxide 기질에 대해서는 (R)-이성질체, benzene ring과 oxirane ring사이에 ether 등의 연결 chain이 있는 기질에 대해서는 (S)-이 성질체에 대한 입체선택적 가수분해능이 우수하였다. A niger LK의 EHase 유전자를 RT-PCR 방법으로 클로닝하였고, sequencing을 통해 다른 미생물 유래의 EHase와의 sequence identity 분석 등을 통해 특성을 분석하였다. Yeast 유래의 EHase와는 32% 수준의 sequence identity를 보였으며, Agrobacterisum, Corynebacterium 등의 박테리아 유래 EHase와는 identity가 매우 낮은 특성을 보였다. E. coli 숙주에서 발현된 재조합 EHase의 활성은 라세믹 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 통해 확인할 수 있었다. 클러닝된 EHase의 보다 효율적인 발현 연구가 필요하며, 이러한 재조합 EHase는 고부가가치 광학활성 에폭사이드 제조를 위한 생물전환공정 시스템의 생촉매로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 미생물학회지
• /
• 제51권3호
• /
• pp.187-193
• /
• 2015

Candida (Pseudozyma로도 알려짐) antarctica lipase B(CAL-B)는 학문적으로 그리고 산업적으로 많이 활용되고 있다. CAL-B 자체에 대한 연구는 많이 진행되어온 반면, CAL-B 상동체에 관한 연구는 그리 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 단백질 유사성 검색을 통해서 CAL-B의 상동체 탐색을 수행하였고, 6종의 단백질 서열을 찾았다. 해당하는 유전자들을 대장균에 대한 코돈 최적화를 수행하였고, 이를 바탕으로 유전자 합성을 진행하였다. 이들 유전자를 대장균 발현용 벡터에 클로닝한 후, 대장균 내에서 단백질 발현을 시도하여 이들 중 4종의 단백질이 성공적으로 발현되었다. 이들 단백질들이 가수분해 효소로서의 활성이 있는지 확인하기 위해서, 4-nitrophenyl acetate와 4-nitrophenyl butyrate를 반응기질로 하여 가수분해 반응성을 확인하였다. 이들 단백질들의 비활성(specific activity)값은 $(1.3-30){\times}10^{-2}{\mu}mol/min/mg$로 측정되었고, 이는 CAL-B의 비활성 수치보다는 다소 낮은 값에 해당하였다. (${\pm}$)-1-phenylethyl acetate의 가수분해 반응에 대한 입체선택성은 이들 상동체 효소들 중에서 Pseudozyma hubeiensis SY62에서 유래된 효소만이 CAL-B의 입체선택성과 유사함이 확인되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제36권3호
• /
• pp.189-194
• /
• 2008

Phospholipase B(PLB) families는 phospholipase(PL), lysophospholipase(LPL) 그리고 lysophospholipase-transacylase(LHA)의 활성을 공유하고 있는 효소이다. 본 연구에서는, 사상성 진균인 Aspergillus nidulans에서 최초로 lipase motifs를 보유하고 있는 단백질 Phospholipase B를 인코딩하는 유전자(plb A)를 클로닝하였다. plb A는 다양한 PLB 효소들의 lipase 보존영역들의 염기서열 정보에 근거하여 제작한 probe를 이용하여 A. nidulans genomic DNA library로 부터 분리하였다. Phospholipase B 유전자의 염기서열을 결정한 결과 626아미노산으로 구성된 단백질을 코드하고 있었다. PlbA는 Penicillium notatum의 PLB와는 72%의 높은 상동성을 나타내었으나, 다른 생물유래의 PLA와는 낮은 상동성을 나타내었다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제40권4호
• /
• pp.296-302
• /
• 2012

국내 사찰에서 제조된 된장으로부터 내열성 ${\alpha}$-amylase 생산균으로 분리된 YB-1234는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA 유전자 염기서열에 근거하여 Bacillus licheniformis로 동정되었다. B. licheniformis YB-1234의 ${\alpha}$-amylase 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정하였으며 그로부터 유추된 ${\alpha}$-amylase의 아미노산 서열은 glycosyl hydrolase family 13에 속하는 B. licheniformis의 내열성 ${\alpha}$-amylases와 매우 높은 상동성을 보였다. ${\alpha}$-Aamylase 유전자를 함유한 재조합 대장균과 B. licheniformis에 의해 각각 생산된 ${\alpha}$-amylase는 pH 6.0에서 최대활성을 보였으나, 최적 반응온도는 약간의 차이가 있었다. 또한 B. licheniformis로부터 ${\alpha}$-amylase는 재조합 대장균에서 생산된 효소보다 열안정성이 매우 높았다. 이들 효소에 의한 maltotetraose와 maltohexaose의 주된 가수분해산물로는 glucose, maltose 및 maltotriose가 관찰되었다.

• 미생물학회지
• /
• 제42권1호
• /
• pp.77-81
• /
• 2006

구름버섯균 KN9522로부터 분리한 Mn-peroxidase 동위효소 CVMP1, CVMP2, CVMP3 및 CVMP5를 코딩하는 게놈유전자를 분리하기 위해 4개의 동위효소 N-말단아미노산서열을 기준으로 제작한degenerate primer들이 사용되었다. 하나를 제외한 3개의 동위효소들은 그에 대응되는 염기서열 900정도 되는 PCR산물 (cmp1, cmp2 및 cmp5)을 얻었다. NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하여 PCR산물들의 염기서열을 분석한 결과, cmp1, cmp2 및 cmp5는 구름버섯균 PRL572로부터 분리한 유전자 MPG-I (등록번호 Z30668) 및 PGV-II(등록번호 Z54279)와 유사하였다. cmp1과 cmp2는 MPG-I유전자의 염기서열과 각각 77%및 95%의 상동성을 보였고 cmp5는 PGV-II 염기서열과 88%의 상동성을 보였다. 본 실험을 통하여 저자들은 Mn-peroxidase 동위효소계의 아미노산 서열을 기준으로 제작된 degenerate primer들을 사용하여 게놈 DNA조각을 분리할 수 있었다.