둥근마 액체배양에서 소괴경의 생산을 위하여 배양온도와 일장의 전환과 배양 배지의 교체 효과를 조사하였다. 둥근마 액체배양에서 식물체의 증식을 위한 일장시간은 6주의 배양기간 동안 $25^{\circ}C$에서 16시간보다는 24시간이 효과적이었다. 기내소괴경의 생산을 위하여 배양기간을 12주로 연장하여 배양하였으며, 배지교체의 효과를 검토하기 위하여, 배양 중기인 배양 후 6주째에 새로운 배지로 교체하였더니, 배지를 교체하지 않은 것보다 소괴경의 형성수가 평균 5개씩 더 많았고, 소괴경무게도 70% 이상 증가하였다. 배양환경의 전환이 소괴경 형성에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 12주의 배양기간 중에 식물체 생장이 활발한 초기 6주간은 $25^{\circ}C$에서 24시간의 일장환경에서 배양하고, 이후 6주간의 배양온도와 일장시간을 전환하였다. 배양온도는 $25^{\circ}C$가 $15^{\circ}C$보다 효과적이었고, $25^{\circ}C$에서 일장시간은 24시간이 암처리 또는 8시간 일장처리보다 효과가 있었다. 12주간의 배양기간중에 배지 교체의 적절한 시기는 배양 후 2, 4, 6, 8, 10주째 또는 배지 무교체 처리구중에서, 생체중, 마디수, 소괴경수에서는 2주 또는 6주째에 교체하는 것이 좋았고, 소괴경중은 8주째 교체 처리구에서 가장 무거웠으나 소괴경의 수와 무게를 모두 고려하였을 때, 초기 배양 후 6주째에 배지 교체하는 것이 가장 효율적이었다. 12주간의 배양기간 중 배양 후 6주째에 교체할 배지의 성분은 sucrose 30, 60 $g{\cdot}L^{-1}$ 또는 sucrose 60 g + BA 0.1 $mg{\cdot}L^{-1}$ 함유 배지 중에서 sucrose 60 $g{\cdot}L^{-1}$이 함유된 배지로 교체하였을 때, 소괴경의 총무게가 가장 무거워 소괴경의 비대에 가장 효과적이었다. 따라서, 둥근마의 액체배양시 $25{\pm}1^{\circ}C$, 24시간 광조건으로, 마디접종 후 6주째에 sucrose 60 $g{\cdot}L^{-1}$를 함유한 배지로 교체하여 6주간 추가 배양하는 방법이 기내 식물체와 소괴경의 생장과 형성에 가장 효과적이었다.
본 연구는 액체 정치배양한 Inonotus obliquus의 균사체 조성분을 분석하였으며, I. obliquus의 균핵과 진탕배양한 균사체의 성분조성을 비교하였다. I. obliquus 균의 정치배양 균사체가 생산하는 화학성분을 분석한 결과, 단리된 화합물은 lanosterol(1), inotodiol(2), trametenolic acid(3), 3β,22,25-trihydroxy-lanosta-8-ene(6), 3β,22-dihydroxy-lanosta-8,24-diene(A), 3β-hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-al(B) 및 methyl trametenolate(C)이 확인되었다. 액체진탕배양 균사체가 생산하는 화합물과의 비교에 의해, 공통화합물은 lanosterol(1)이었고, ergosterol(7)과 ergosterol peroxide(8)는 액체진탕배양, lanosterol(1)의 C-21치환화합물과 C-22치환화합물은 정치배양함으로써 얻어짐을 알 수 있었다.
강한 제초활성을 띠는 곰팡이 균주 YK101의 배양조건을 최적화하기 위하여 균사와 균체 생산에 대한 온도, 교반속도 그리고 배양배지의 영향을 조사하였다. YK101의 최적 배양온도와 교반속도는 각각 $28^{\circ}C$, 150rpm 이었다. 최적화된 배지조성은 1.0$^{\sim}$2.0% total sugar, 1.0% yeast extract 그리고 0.05% $MgSO_4$${\cdot}$$7H_2O$이었다.
영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀이 항당뇨 효과에 미치는 영향을 알아보기 위하여 영지버섯의 액체배양과 유기 한국 토종 쌀에서의 영지버섯 배양 및 생산된 유기 한국 토종 영지버섯 쌀을 당뇨가 유발된 흰쥐에 경구투여한 후, 혈당, 혈청 지질 및 alanine aminotransferase(ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 활성을 조사하였다. 영지버섯 액체배양 조건은 pH가 4.5와 5.0이고, 온도는 $30^{\circ}C$에서 최적인 것으로 나타났고, 유기 한국 토종 영지버섯 쌀 생산 조건으로는, 물리적 형태나 배양 조건 등을 고려했을 때, 1kg의 토종 쌀에 7.5%의 종균을 접종하여, $28^{\circ}C$에서 9일간 배양하는 것으로 나타났다. 혈당 강하 효과 시험에서 당뇨 유발군에서, 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈당의 감소정도가 대조군보다 유의하게 감소하였다. 또한 영지버섯으로 배양된 유기 한국 토종 쌀의 급여군에 있어서의 혈장 total cholesterol과 triglyceride는 대조군에서 보다 낮은 수치를 나타내었고, ALT와 AST 활성은 대조군에서 보다 낮은 수치를 나타내었다.
Agrobacterium rhizognes $A_4$ Ti-plasmid를 인삼 뿌리에 도입하여 유전적으로 안정하며 반영구적으로 이용할 수 있는 형질전환된 인삼모상근 캘러스(GHC-T78)를 유도하였다. 특정 ginsenoside를 대량으로 생산할 수 있는 최적배양조건을 확립하기 위해서 먼저 모상근으로부터 캘러스의 유도하는 과정에서 BA의 단독 처리구는 auxin과 cytokinin의 혼합 처리구보다 캘러스 형성이 더 우수하였다. 인삼 캘러스 형성율은 Benzyladenine(BA)를 1 mg-3 mg/L 까지 첨가한 배지에서 가장 높게 나타났으며, ginsenoside 함량 역시 bezyladenine 단독처리구는 가장 우수하였다. 캘러스 세포의 액체배양 기간을 4주로 설정할 때 BA의 농도 역시 BA 2 mg/L로 첨가한 배지에서 가장 우수한 캘러스 생장률을 보였다. 실제로 인삼 모상근 캘러스의 생장율은 암상태에서 배양하는 것이 광상태에서 보다 다소 양호하였으나, ginsenoside의 생성에는 연속광상태에서 더 효과적임이 확인되었다. 모상근 캘러스에서 얻은 이러한 결과는 국내외 처음으로 보고되는 내용이며, 액체배양의 캘러스 세포에서 분화된 무수히 많은 단일 모상근 근모의 형성은 액체배양을 통한 특정 ginsenosid의 새로운 생산방법을 개발할 수 있도록 하고 있다.
버섯의 액체배양에 의한 균사체 및 세포외 다당 발효의 안정성과 생산성 증가를 도모하기 위하여, 영지(Ganoderma lucidum ASI 7004)의 액체배양 중, 배지조성($0{\sim}11\;g/l$의 ammonium)을 달리하여 균사체 형태 및 분화의 경시변화를 영상분석 시스템을 이용하여 분석하였다. 배지 조성 및 배양 조건에 따른 균사체 형태의 배양경시변화를 영상분석한 결과, non-branched long filamentous mycelium, non-branched short mycelium, branched long filamentous mycelium, branched short mycelium, entangled mycelium 및 각종 clump의 필라멘트 형태와, smooth pellet, rough pellet 및 hollow rough pellet의 펠렛 형태 등, 다양한 형태를 관찰할 수 있었다. Ammonium ion이 낮은 경우에는 필라멘트 형태의 균사 생육이 주인 반면, 높은 농도로 갈수록 펠렛 형태의 균사 생육이 주로 관찰되었다. 이러한 형태의 변화를 수치화 하는 수단으로 fractal 차원을 이용하여 형태를 분류한 결과, 11 g/l의 ammonium phosphate 농도에서 주로 나타나는 균사형태의 fractal 차원을 이용하여 형태를 분류한 결과, 11 g/l의 ammonium phosphate 농도에서 주로 나타나는 균사형태의 fractal 차원은 1.05 이었으나(펠렛형), ammonium phosphate의 결핍 시에 주로 나타나는 균사 형태의 fractal 차원은 1.3이었다(필라멘트형). 또 필라멘트형 및 펠렛형 균사체가 공존할 때의 fractal 차원은 1.16으로, 이들의 중간 값을 나타내었다. 따라서, fractal 차원은 균사 형태의 변화를 측정하는 지표 값으로 매우 유용할 것으로 생각되었다. 또 원형도는 펠렛형 균사체의 표면에서 균사 생육 정도를 판정하는데 유용한 것으로 나타났다.
두릅나무의 엽병을 1.0 mg/L 2,4-D가 포함된 MS 고체배지에서 배발생캘러스를 유도하였다. 배발생세포와 배발생세포괴는 1.0 mg/L 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배발생캘러스를 2주간 현탁배양하여 대량으로 얻었다. 그물망을 통과한 배발생세포는 1.0 mg/L 2.4-D가 포함된 MS 액체배지에서 배양하면 배발생능이 소실되지 않고 지속적으로 유지 및 증식시킬 수 있었다. 그물망을 통과하지 못한 배발생세포괴를 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2 MS 액체배지에 옮겨 2주간 배양하면 구상형의 체세포배로 발달하였다. 구상형의 체세포배는 5 L의 bioreactor를 이용하여 배양하면 심장형, 어뢰형, 자엽형의 배와 유식물체로 발달하였다. Bioreactor 배양을 통해 두릅나무의 체세포배를 효과적으로 대량증식 시킬 수 있었다.
자색고구마 (Ipomoea batatas cv. Jami) 잎 조직배양으로 유도된 캘러스는 계대배양시 생장량이 감소하였다. 빠르고 간편하게 생장하는 습관성캘러스를 $1{\mu}M\;2,4-D$ 첨가된 MSBM에서 계대배양 없이 6개월간 지속배양하여 선발하였다. 습관성캘러스는 생장조절제가 첨가되지 않는 MSBM의 고체, 액체 배지에서 계대배양 횟수의 제한 없이 빠르게 지속생장이 가능하였다. 암조건의 액체배양 6 개월 후에는 자색생합성 부위가 생겼으며, 이를 2년 여간 분리하여 자색습관성세포괴를 선발하였다. 안토시아닌 함량은 자미의 괴근에서 추출되는 1.5 mg/ml에 근접한 1.0 mg/ml으로 나타났다. 자색습관성 세포괴는 안토시아닌 기내대량에 효과적 세포주로 사용 될 수 있을 것으로 기대한다.
레드 클로-버의 액체배양세포로부터 내산성 세포선발에 대한 몇가지 요인들의 영향을 규명하기 위한 실험으로 부터 다음과 같은 결과들을 얻었다. 액체배양세포의 유도에는 auxin원으로 2,4-D 2 mg/l와 cytokinin으로 BAP 0.5 mg/l를 혼합처리한 것이 가장 좋았으며, 여러가지 기본배지중 PC배지가 액체배양세포의 유도에 가장 효과적이었다. 내산성 세포를 선발하기 위하여 EMS를 여러가지 농도에서 4시간 처리했을 때, 가장 효율적인 EMS농도는 1 %였으며 이 때 plate당 평균 27개의 colony가 선발되었다. 1%의 EMS를 처리한 결과 내산성 세포발생빈도는 8.9$\times$$10^{-5}$으로서 EMS 무처리구의 100배나 높은 수준으로 나타났으며 최초에 선발된 변이주는 총 176주였으나 선택배지에서 4주간격으로 2회 계대배양 후 살아남은 colony수는 44주였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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