• 제목/요약/키워드: 실시간 정량적 중합효소연쇄반응

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SYBR Green 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 이용한 개 싸이토카인 유전자 발현의 정량 (Development and Evaluation of a SYBR Green Real-time PCR Assay for Canine Cytokine Gene Expression)

  • 유도현;인동철;박철;박진호
    • 한국임상수의학회지
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    • 제27권5호
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    • pp.508-513
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    • 2010
  • 싸이토카인은 염증 및 면역 반응의 평가에 있어서 매우 중요한 요소이다. 따라서 이들의 mRNA 수준을 정량하고 평가하는 것은 염증 및 면역 반응을 평가하는데 있어서 그 민감도가 매우 높은 방법으로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 SYBR green dye를 이용하여 개의 싸이토카인 mRNA를 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time reverse transcriptase PCR; qRT-PCR)으로 분석을 할 수 있도록 함에 있다고 할 수 있다. 제작된 시발체(primer)의 최적화된 붙임 온도(annealing temperature; $T_a$)는 인터루킨(interleukin; IL)-$1{\beta}$, IL-6, IL-10이 각각 $62^{\circ}C$, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)와 tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$$60^{\circ}C$ 그리고 high mobility group box 1 (HMGB1)이 $58^{\circ}C$였다. 표준 정량 곡선을 이용하여 측정한 시발체의 효율성은 97.1%에서 102.%로 매우 높았고, 2차 구조물(secondary structure)과 시발체-이합체 형성(primer-dimer formation)은 융해곡선(melt-curve)분석과 전기영동을 통해 확인하였다. 이렇게 정립된 qRT-PCR 분석법은 민감도와 특이도가 매우 높은 개 싸이토카인 유전자 정량법으로 활용될 수 있을 것이다.

(${\Delta}^{12}PGJ_2$ 및 PPAR 감마 길항체가 조골세포의 증식 및 분화에 미치는 효과 (The Effect of ${\Delta}^{12}PGJ2$ and $PPAR{\Gamma}$ Agonist on the Proliferation and Differentiation of Osteoblast)

  • 허정미;김경화;정경욱;이혜준;류인철;구영;정종평
    • Journal of Periodontal and Implant Science
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    • 제35권1호
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    • pp.133-152
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    • 2005
  • 1. 목적 Prostaglandin은 치주질환과 관련된 국소적 골 대사에 중요한 역할을 한다. ${\Delta}^{12}PGJ_2$는 생체 내에서 혈장의 존재 하에 형성되는 천연 $PGD_2$ 대사산물이며 peroxisome- proliferator에 의해 활성화되는 감마 수용체 (PPAR ${\Gamma}$)에 대해 높은 친화성을 갖는 리간드로서 핵 수용체군에 속하는 전사조절인자이다. 이 연구의 목적은 골화 과정에서 ${\Delta}^{12}PGJ_2$의 역할을 규명하기 위해, 조골세포주의 증식과 분화에 미치는 영향과 그에 관련된 세포기전을 조사하는 데에 있다. 2. 방법 인간 골육종세포주인 Saos-2 (ATCC.HTB 85)와 쥐의 조골세포주 (MC3T3-E1)를 배양한 후 실험군에 농도가 각각 $10^{-5}$, $10^{-6}$, $10^{-7}$, $10^{-8}$, $10^{-9}$ 몰인 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 ciglitazone (합성 PPAR 감마 길항체)를 첨가하였다. 조골세포에서 PPAR 감마의 발현을 관찰하기 위해 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 특정한 primer를 이용하여 시행하였다. 세포 증식은 1일, 2일, 3 일째에 MIT 분석법으로 측정하였고, 2 일째에 알칼리성 인산효소 (ALPase) 생산을 측정하였다. 위의 결과에서 얻은 적정한 농도에서 다양한 조골세포 분화의 표지자들-제 1 형 교원질, 알칼리성 인산효소, osteopontin 및 bone sialoprotein-에 대한 간이 정량적 역전사효소-중합효소연쇄반응 (semiquantitative RT-PCR)을 실시하였으며 골결절 형성에 대한 효과를 알아보고자 석회화 분석도 시행하였다. 3. 결과 ${\Delta}^{12}PGJ_2$와 ciglitazone 모두 Saos-2 세포주의 증식을 촉진시켰다 .$10^{-8}$ 몰의 ${\Delta}^{12}PGJ_2$$10^{-6}$몰의 ciglitazone을 첨가한 실험군을 대조군과 비교했을 때, 시간에 비례하여 세포 증식률이 증가되었다. 알칼리성 인산효소의 활성화 검사에서도 증식률에서와 유사한 결과를 보여주었다. 간이 정량적 RT-PCR에서는 ${\Delta}^{12}PGJ_2$로 처리한 군의 경우 제 1 형 교원질, 알칼리성 인산효소, osteopontin, 그리고 bone sialoprotein의 상대적 mRNA 수준이 유의하게 높았다. 석회화 분석에서는 MC3T3-E1 세포를 $10^{-6}$ 몰의 ${\Delta}^{12}PGJ_2$로 처리한 군과 $10^{-5}$ 몰의 ciglitazone으로 처리한 군에서 현저한 골결절 형성을 보였다. 이러한 결과들은 ${\Delta}^{12}PGJ_2$가 유용한 골 유도물질이 될 수 있으며 또한 그 작용기전이 PPAR 감마-의존형 경로와 연관되어 있음을 보여준다.

뒤영벌 병원체 11종에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응 검출법 개발 (Development of real-time PCR Detections against 11 Pathogens of Bombus Species)

  • 민상현;김정민;임수진;김병희;이칠우;윤병수
    • 한국양봉학회지
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    • 제32권2호
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    • pp.99-109
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    • 2017
  • DWV, IAPV, KBV, SBV, BQCV, kSBV, SBPV and Paenibacillus larvae, Mellisococcus plutonius, Lysinibacillus fusiformis, Klebsiella oxytoca의 뒤영벌 병원체들에 대한 다중 실시간 중합효소 연쇄반응법(PCR)을 개발하였다. 하나의 시료에서 추출된 핵산은 11종 PCR들에 같은 시간 및 조건으로 사용될 수 있으며, 각 병원체 특이 표적 DNA가 PCR 기질로 1000분자가 존재한다면, 해당 특이 PCR 증폭산물들은 정성적, 정량적으로 20분안에 성공적으로 증폭되었다. 우리가 제안하는 이 다중 PCR 검출법이 뒤영벌의 국제교역을 위한 검역검사에 사용되기를 기대한다.

실시간 정량 중합효소연쇄반응을 이용한 광산 배수의 수계 영향 평가 (Evaluation of the Effect of Mine Drainage on the Aquatic Environment by Quantitative Real-time PCR)

  • 한지선;서장원;지원현;박현성;김창균
    • 대한환경공학회지
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    • 제32권2호
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    • pp.121-130
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    • 2010
  • 산성광산배수(Acid Mine Drainage; AMD)는 낮은 pH조건에서 중금속 및 황산염이온 등이 다량 용존되어 환경오염 문제를 발생시킨다. 국내의 폐광산 일부에서는 산성광산배수를 처리하기 위해 정화시설이 운영되고 있으나 여전히 주변 하천에 영향을 미치고 있다. 본 연구는 산성광산배수 및 영향을 받는 하천에서 지표미생물의 특이적 유전자를 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction; Real-time qPCR)을 이용하여 확인 및 정량함으로써 광산배수의 환경영향을 미생물학적으로 판단하고자 수행되었다. 지표 종으로 선정한 미생물은 16S rRNA 미생물 군집분석 결과 발견된 미생물 중 철환원균인 Rhodoferax ferrireducens T118, Acidiphilium cryptum JF-5이며 이 외에 기존에 광산에 존재하는 것으로 알려진 미생물 중 호산성 황환원균인 Desulfosporosinus orientus, 철산화균인 Leptosprillum ferrooxidans, 철 및 황산화균인 Acidothiobacillus ferrooxidans이었다. 최종적으로, 본 연구에서 각 광산의 광산배수가 하천에 미치는 영향을 정량적으로 판단하여 비교하기 위해 광산배수로 인한 하천에서의 미생물 변동 지수를 산정하였으며 연구 대상 4개 광산 중 광산배수 처리시설이 없는 삼탄의 광산배수의 경우 주변 방류 하천으로의 미생물학적 환경영향이 가장 큰것으로 나타났다

생쥐 초기 배아에서 Aquaporin 8과 9의 발현에 관한 연구

  • 신현상;계명찬;강수만;이성은;이지원;강한승;김문규
    • 한국발생생물학회:학술대회논문집
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    • 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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    • pp.68-68
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    • 2003
  • Aquaporin은 막관통 통로 단백질(transmembrane channel protein)로서, 삼투압의 농도구배에 따라 세포막을 가로질러 물분자를 이동시키는 기능을 하고 있다. 포유류 초기배아에서 포배강 형성은 영양외배엽세포에서 $Na^+ / K^+$ATPase에 의한 이온 농도 구배가 형성되면 auqaporin에 의해 물이 포배강으로 유입되면서 이루어진다. 본 연구에서는 생쥐 초기배아에서 반정량적인 역전사 중합효소 연쇄반응 방법(semi-quantitative RT-PCR)과 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법(real-time RT-PCR)을 통하여 AQP8과 9의 mRNA발현을 조사하고 다중 면역형광현미경 방법(confocal immunofluorescence microscopy)을 통해 단백질 발현양상을 분석하였다. AQP8 mRNA는 상실기까지 발현되지 않다가 포배기에 이르러 발현되었고 AQP9 mRNA는 수정란에서부터 발현되어 포배기에는 유의할 정도로 증가하였다. 따라서 AQP8 mRNA는 배아유전자가 활성화되어 나타나는 것이고 AQP9 mRNA는 모계유전자 기원임을 알 수 있었다. AQP8 단백질은 상실배 단계까지 발현되지 않다가 포배시기에 영양외배엽세포사이의 접합면에 발현되었고 AQP9 단백질은 상실배 시기에 할구 사이의 인접 부위에서 강하게 발현되었다가 포배시기에는 세포간의 접합면에 약하게 발현하는 경향을 나타내었다. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 방법으로 조사한 결과 포배에서 물과 글리세롤을 통과시키는 AQP9는 mRNA의 발현양이 AQP8보다 약 4배 정도 많았다. 또한 포배기에 이르러서야 물만을 통과시키는 AQP8의 발현이 나타나는 것을 보아 포배강 형성시 외부에서 영양외배엽을 통해 포배강으로 유입되는 물의 이동(trans- trophectodermal water movements)에 AQP9보다 AQP8이 더 중요하게 관여할 것으로 사료된다., K, Pb, Cd, Cr, Co, Cu, Ni)을 측정하였다. 실험 조건1의 결과로서 각 국의 유아용 일회용 기저귀의 중금속 함량은 거의 유사한 경향을 나타내었으며 Cr, Zn, Pb, Ni, Mn, Mg, Li, K는 detection limit(2 ppm) 이하였고, Cd, Fe, Co, Cu, Ca, Al, Sr는 검출되었지만 기준치 이하였다. 실험 조건2의 결과로서 측정 항목(Cr, Sb, Cd, Pb, Ni, Co, Cu)중 Cr, Cd, Ni, Cu는 detection limit(0.1 ppm) 이하였고, Sb, Pb, Co는 검출되었지만 기준치 이하였다.았다. 4%의 경우에는 8$0^{\circ}C$이하로 온도를 낮추는 것이 좋은 상태를 나타내었다. 이와 같은 결과는 일반적으로 화학적 레팅을 4%, 7%에서한 선행결과와 상당히 다른 결과이다.염 농도가 증가할수록 감소 현상을 보였다.X>, 75BG30은 8.6$\mu\textrm{m}$, 75BG40은 7.02$\mu\textrm{m}$로 나타났다. 따라서 경화제 양에 관계없이 10$\mu\textrm{m}$ 이하로 나타나, 경화제 10$m\ell$만으로 미세한 크기를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 젤리 강도 변화에 따른 차이는 300BF는 78.09$\mu\textrm{m}$ 300BG는 56.32$\mu\textrm{m}$로, 75BF나 75BG에 비하여 현저히 증가하여, 젤라틴의 젤리 강도는 캡슐 제조 조건의 주요한 변수임을 알 수 있다.추출물 투여시 혈당강하 및 혈중콜레스테롤 강하가 나타났으며, 상엽복합추출물 투여와 운동을 병행시 이러한 감소 효과가 더 뚜렷하게 나타났다.교육의 적임자로 보는 시각이 비교적 높았고 약 1/2정도는 영양교육에 참여하겠다는 의지를 가지고 있을 뿐만 아니라 실제로 영양지도를

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어린 돌기해삼 Apostichopus japonicus (Echinodermata; Holothuroidea) 방류 방법에 따른 열충격단백질90 유전자의 발현 분석 (Heat Shock Protein 90 Gene Expression in Juvenile Sea Cucumber Apostichopus japonicus (Echinodermata; Holothuroidea) according to Releasing Methods)

  • 이동한;이승헌;정동빈;손영창
    • 한국해양생명과학회지
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    • 제7권1호
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    • pp.29-36
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    • 2022
  • 돌기해삼 Apostichopus japonicus는 주요 양식 대상 무척추동물로서 우리나라 연안 해역에 서식하고 있다. 본 연구는 방류 방법에 따른 단기간의 생리학적 스트레스 정도를 평가하기 위하여 heat shock protein 90 (HSP90) 유전자의 발현 변화를 실시간 정량적 중합효소연쇄반응법으로 조사하였다. 어린 돌기해삼을 비닐봉지에 산소 포장하여 30분간 수송하거나 방류 해역의 간조기에 1시간 공기 중에 노출된 실험군의 HSP90 유전자 발현은 대조군의 HSP90 유전자 발현에 비하여 통계학적으로 유의미하게 증가하였다(수송 후 실험군 p=0.001; 간조기 실험군 p=0.032). 어린 돌기해삼을 방류 후 6시간까지 분석한 결과, 선상에서 씨뿌림 방식으로 방류된 6시간째의 개체 및 호스를 통과하여 수중으로 방류된 2~6시간째의 HSP90 유전자 발현율은 대조군에 비하여 약간 감소하는 경향을 보였다(씨뿌림 실험군 p=0.069; 호스 방류군 p=0.093). 한편, 잠수부에 의해 수중에서 방류된 어린 돌기해삼은 방류 후 시간이 경과할수록 HSP90 유전자 발현율은 증가하는 패턴이 관찰되었다(p=0.061). 이상의 결과는 방류된 어린 돌기해삼의 단기간 스트레스 반응 연구와 효과적인 방류 방법의 개발에 HSP90 유전자 발현이 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

실시간중합효소연쇄반응을 이용한 유전자변형 콩 가공식품의 정량분석 (Quantitative Analysis of Genetically Modified Soybean in Processed Foods Using Real-time PCR)

  • 민동명;김묘영;정순일;허문석;김진국;김해영
    • 한국식품과학회지
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    • 제36권5호
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    • pp.723-727
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    • 2004
  • 콩 가공식품인 두유, 두부, 비지에서 유전자변형 콩에 삽입된 epsps 유전자의 검출과 정량을 위해 정성과 정량 PCR 방법을 수행하였다. 두유, 두부, 비지에서 유전자변형 콩의 검출은 삽입된 epsps 유전자의 증폭이 크기가 121bp와 330bp가 생성될 수 있는 두 종류의 primer들을 이용하여 0.01%까지 확인하였다. 정량방법은 1, 3, 5%의 유전자변형 콩이 포함된 시료들을 실시간 PCR을 사용하여 유의성 있는 결과를 얻었다. 이러한 결과들은 실시간 PCR 방법을 사용하여 가공식품 내에서 정량적으로 유전자변형 콩을 정량하는데 적용될 수 있음을 보였다.

Real-time PCR을 이용한 임플란트주위염 원인균의 정량적 분석 (Quantitative detection of peri-implantitis bacteria using real-time PCR)

  • 김민정;한경순
    • 한국치위생학회지
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    • 제21권5호
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    • pp.555-565
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    • 2021
  • Objectives: This study was conducted to analyze peri-implantitis bacteria and identify their associations with health status and health activities. Methods: Gingival sulcus fluid at the implant's periodontal pockets sampled from the participants were analyzed by multiplex real time PCR. Results: Participants had strains in the order of 100% F. nucleatum, 98.0% E. corrodens, and 96.0% P. micra, and the correlation between C. rectus and E. nodatum was high (p<0.01). Diabetic group (P. gingivalis, P. nigrescens) hypertension (P. nigrescens), group with four or more periodontal pockets (P. gingivalis, T. dentica, P. intermedia, E. nodatum, and C. rectum), smoking (P. micra, E. corrodens), drinking (T. dentola), and scaling groups (C. rectus) were found to have more strains (p<0.05). Conclusions: Representative pathogenic microorganisms detected in periodontal pockets of implants were similar to dental periodontal pockets; however there were differences in the amount and distribution of microorganisms, and they were affected by health status and health behavior.

출토 인골 DNA의 real-time PCR 정량에 의한 보존상태 평가 연구 - 부여 오수리 출토 인골을 중심으로 - (Evaluation of the preservation state of human skeletal remains using real-time PCR)

  • 권은실;조은민;김수훈;강소영
    • 보존과학연구
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    • 통권32호
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    • pp.171-183
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    • 2011
  • 본 연구는 충청남도 부여군 규암면 오수리 유적에서 발굴된 인골 4개체를 대상으로 조직학, 분자유전학, 골화학 분석 등 종합적인 연구를 통해 이들의 상관관계를 규명하고자 하였다. 실체현미경을 통해 인골 시료의 골조직 단면 구조를 관찰함으로써 각 시료의 조직학적 보존 상태를 단계별로 구분하였고, 잔존하는 단백질의 보존 상태는 콜라겐을 추출하여 수율을 측정함으로써 평가하였다. 또한 미토콘드리아 cytochrome b 유전자를 이용한 실시간 유전자 증폭법을 이용하여 각각의 인골 시료에 잔존하는 미토콘드리아 DNA의 상대적 보존량 및 복제수를 분석하였으며, 미토콘드리아 과변위부위의 염기서열을 동정하였다. 본 연구 결과 인골 시료의 조직학적 보존정도, 콜라겐 단백질의 잔존량, 미토콘드리아 DNA의 복제수는 상호 긍정적인 연관관계로 나타났다. 이 연구는 출토 인골의 생물 화학적 분석 가능성을 예측하기 위한 특성지표 연구의 중요자료로 활용 될 수 있을 것이다.

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Mutans streptococci의 자일리톨 내성균주와 감성균주의 glucosyltransferase mRNA의 정량적 비교 연구 (Quantitative comparison of mRNA expression of glucosyltransferase (GTF) between $xylitol-resistant(X^R)$ and $xylitol-sensitive(X^S)$ mutans streptococci)

  • 이미나;김영재;이성훈;김종철
    • 대한소아치과학회지
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    • 제33권1호
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    • pp.77-84
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    • 2006
  • 자일리톨에 장기간 노출된 mutans streptococci는 자일리톨에 내성이 발현되어 자일리톨 내성균주가 생성된다고 알려져 있다. 본 연구의 목적은 mutans streptococci에서 자일리톨 내성균주와 감성균주의 gtf유전자 발현량을 각각의 유전자별로 정량적으로 분석하고 비교하는 것이다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응법을 이용하여 각각의 gtf발현을 조사한 결과 gtfD는 증가한 반면, gtfB와 gtfC는 감소하였는데 이는 각 유전자의 독립된 조절기전이 존재함을 보여주는 것이다. 또한 자일리톨에 노출된 mutans streptococci에서의 glucosyltransferase와 연관된 유전자변형이 자일리톨의 치아우식증 예방효과의 작용기전 중 하나임을 알 수 있었다.

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