초파리(Drosophila melanogaster)의 두부를 항원으로 사용하여 신경계 특이적인 단일클론항체를 제작하였다. 이 항체의 항원은 expression cDNA library screen을 한 결과 tyrosine kinase substrate의 일종인 disabled 분자를 인식하고, DNA sequencing결과 disabled 단백질의 C-말단부분인 7427에서 8761bp 사이를 특이적으로 인식한다는 것을 알 수 있었다. 이 항원의 국재를 조사한 결과 초기발생단계의 배에서는 중추신경계에 강하게 발현되었으며 성충에서는 시신경계와 뇌신경계 그리고 흉부신경계의 축색돌기가 밀집한 부분에 특이적으로 발현되었고, 또한 근육신경에서도 발현되는 것을 알 수 있었다. 따라서 disabled 분자는 배발달단계에서 중추신경계의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 예상되고, 성체에서는 신경계의 축색에서 뿐 아니라 근신경계에서도 어떤 기능을 수행하는 것으로 사료된다.
신경과흥분은 신경세포의 수지돌기 말단부에 있는 흥분성 수용체에 대한 과도한 자극에 의해서 신경세포가 손상을 받는 현상으로 transcription factor의 발현을 유도하여 통증을 유발하는 자극, 학습, 발작, 흥분, 신경변성, 저산소성 국소빈혈, 뇌신경손상, 신경절제, 약제내성 등의 원인이 된다. 신경과흥분은 정상농도 이상의 NMDA에 의해서도 유발되는데 본 논문에서는 mouse의 복강으로 과량의 NMDA를 투여하여 소뇌에서 RT-PCR 방법으로 Inducible transcription factors (Egr-1, c-jun, JunB, FosB) mRNAs의 상대적 발현량을 비교하였다. NMDA를 투여한 군에서 inducible transcription factors (Egr-1, C-Jun, JunB, FosB)가 투여량과 시간의 경과에 따라 다양한 발현의 변화를 보였으며, NMDA투여 후 일정한 시간에서 투여한 양에 대한 변화는 체중 g 당 5 μg의 NMDA투여한 경우에 현저한 변화가 나타났다. 조사한 transcription factor 중에서 JunB의 발현 변화가 다른 transcription factor보다 두드러지게 나타났다. NMDA 투여량이 일정할 때 투여 후 경과 시간에 따른 발현양상은 투여 후 24시간이 경과한 후에 발현의 변화가 두드러지게 증가하는 경향을 나타내었고 대부분 이 48시간 경과 후 발현이 최고치에 도달하였다. 이러한 결과는 과흥분이 유도된 소뇌에서의 유전자 발현의 변화를 2D-gel 또는 microarray와 같은 방법을 이용하여 세포 내의 전체 단백질 혹은 유전자의 변화를 관찰함으로써 NMDA 수용체의 과흥분에 의한 뇌세포의 사멸에 관련된 기전을 밝힐 수 있는 좋은 자료가 될 수 있을 것으로 기대된다.
수면은 외부의 자극에 대해 반응하지 않는 상태로 만성통증을 지닌 환자는 수면 장애를 겪고 있으며 수면장애는 통각과 민한 상태를 유발하고 통증인지에 영향을 미친다. 구강작열감 증후군은 구강점막에 화끈거리는 감각을 포함하는 만성 안면통증으로 감각과 통증 역치가 변성되고 신경병증 징후를 보인다. 구강작열감 증후군은 첫 번째로 국소적, 전신적 요인 즉, 흡연, 투약 등 작열감 증상의 원인으로 가능한 요인을 제거하고, 두 번째로는 환자를 안심시키는데 있다. 수면박탈 내인성, 외인성 아편유사제의 진통효과는 수면 계속성 즉, 선택적인 렘수면 박탈은 아편유사제 진통효과를 방해 하고 opioid protein synthesis 억제를 야기하고 ${\mu}$ 와 ${\delta}$ opioid 수용체 친화력을 감소시킨다. enkephalinase-inhibitor와 MAO-B inhibitor 적용으로 나타나는 아편유사제의 진통상승효과는 렘수면 박탈시에 무효화 된다. 렘수면 박탈후에는 5-HT 와 5-hydroxy indole acetic acid 레벨이 유의하게 감소되고, 아편유사체에 활성에 의해 유발되는 통증억제를 지지하는 세로토닌 체계를 가능하지 않게 한다. 구강작열감 증후군은 설말단 신경섬유에서 추삭변성 변화가 있고 특히, 열자극, 냉자극 및 미각 유해수용성 자극의 인지를 포함한 감각변화가 폐경기후 생식스테로이드의 급격한 감소가 신경활성 스테로이드 생성에 변성을 일으켜며, 이것은 말초성 변성와 중추성 변성이 존재함을 제시한다. 구강작열감 증후군은 기본적으로 가능한 요인을 제거하는 것이 중요하므로 구강작열감의 진행을 방지하고, 만정적인 작열감의 경감을 위하여 증상 경과에 영향을 미칠 수 있는 수면에 대하여 고찰하고자 한다.
Fabry 병은 성염색체 연관 유전성 리소좀 대사 질환으로 ${\alpha}$-galactosidase A 를 코딩하는 GLA 유전자의 변이로 인한 ${\alpha}$-galactosidase A 효소의 결핍에 의해 발생한다. 이 질환은 globotriaosylceramide (GL-3) 및 관련된 글리코스핑고리피드(glycophospholipids)가 신장 사구체, 심근, 후근 신경절 및 자율 신경계, 혈관 내피 세포 및 평활근 등에 축적되어 사지 말단 동통, 신부전, 심부전 등의 다양한 임상양상을 보이게 된다. 대증적 요법으로만 치료하던 Fabry 병은 효소대체요법의 발전으로 신부전을 포함하여, 심각한 합병증의 예방 및 호전과 함께 질환의 예후를 향상시키고 있다. 또한 사지 말단 동통은 Fabry 병 환자들의 삶의 질을 특히 떨어뜨리며, 적절한 효소대체요법에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 저자들은 40대 후반에 Fabry 병을 진단받고 효소대체요법을 시작하여 사지 말단 동통이 호전된 중국인 남자 환자에 대해 보고하는 바이다.
신경섬유 말단에서의 유해자극 인지과정에는 신경성장인자 (nerve growth factor [NGF])와 감각성 신경펩티드가 관여하고, 또한 이들은 중추신경계에도 광범위하게 분포되어 있다. 본 연구는 인체 혈액과 타액에서 NGF와 감각성 신경펩티드(substance P [SP], calcitonin gene-related peptide [CGRP])의 농도를 조사하여 다양한 구강안면통증 증상들과의 관계를 알아보고자 시행되었다. 67명의 구강안면통증 환자 (관절 통증, 치아 혹은 치주 통증, 점막 통증)와 36명의 건강한 성인에서 혈장과 안정시 전타액을 채취하여 효소면역분석법 (enzyme immunoassay)을 이용하여 NGF, SP, CGRP의 농도를 측정하였다. 만성통증척도 (Graded Chronic Pain Scale) 설문지를 이용하여 각 피실험자들의 통증강도를 조사하였으며 안정시 전타액의 타액분비율 또한 측정하였다. 관절 통증 환자군은 치아 통증 환자군, 점막 통증 환자군, 대조군 각각에 비하여 유의하게 높은 혈장 내 NGF 농도를 나타내었다. 치아 통증 환자군의 혈장 내 NGF 농도는 대조군에 비하여 유의하게 높았다. 치아 통증 환자군의 타액 내 SP 농도와 점막 통증 환자군의 타액 내 CGRP 농도 또한 대조군에 비하여 유의하게 높았다. 관절 통증 환자군의 혈장 및 타액 내 SP 농도는 통증 강도와 유의한 상관관계를 보였다. 치아 통증 환자군과 점막 통증 환자군에서, 혈장 내 SP 농도, 타액 내 SP 농도, 타액 내 CGRP 농도는 연령에 따라 증가하였다. 혈장과 타액에서의 신경성장인자와 신경펩티드 검사는 다양한 구강안면통증의 특성과 예후를 평가하는데 도움을 줄 수 있으리라 생각된다.
미세소관은 알파- 와 베타-tubulin의 이량체가 종합되어 형성되며, 또한 세포내에서 tubulin 수송은 섬모나 편모와 같은 세포 부착 기관의 성장에 중요한 역할을 한다. Kinesin 2는 kinesin superfamily (KIF)의 분자 모터 단백질의 한 종류로 미세소관를 따라 다양한 운반체를 운반하며, 2종류의 다른 모터 단백질(KIF3A, KIF3B)과 kinesin-associated protein 3 (KAP3)로 구성되어 있다. Kinesin 2는 KIF3A의 cargo binding domain을 통하여 다양한 단백질과의 결합이 알려져 있지만, 아직 결합단백질의 다수는 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 KIF3A와 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid system을 사용하여 탐색한 결과 미세소관의 단위체의 한 종류인 ${\beta}2-tubulin$ type (Tubb2)을 분리하였다. Tubb2는 KIF3A와 결합하지만, KIF3B, KIF5B와 kinesin light chain 1 (KLC1)과는 결합하지 않았다. Tubb2의 C-말단은 KIF3A와의 결합에 필요하며, 다른 KIF3A는 Tubb의 isoforms인 Tubb1, Tubb2, Tubb3, Tubb4, Tubb5와도 결합하였다. 그러나 Tuba1은 KIF3A와 결합하지 않았다. 생쥐의 뇌 파쇄액을 KIF3A 항체로 면역침강한 결과 Tubb2는 heterotrimeric kinesin 2의 구성단백질들과 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 heterotrimeric kinesin 2는 tubulin과 결합하여 세포 내에서 tubulins을 운반하는 것을 시사한다.
Kinesin-2는 heterotrimeric kinesin-2와 homodimeric kinesin-2의 두종류가 존재한다. 세포내 미세소관을 따라 이동하는 분자 모터 단백질인 heterotrimeric kinesin-2는 motor 활성을 가진 kinesin superfamily protein (KIF) 3A와 3B (KIF3A와 KIF3B) 그리고 kinesin associated protein 3 (KAP3)로 구성되어져 있다. 특히 섬모내에서 heterotrimeric kinesin-2는 미세소관의 plus방향으로 운반체를 운반하는 역할을 수행한다. Heterotrimeric kinesin-2는 다양한 운반체 그리고 단백질들과의 결합이 알려져 있지만 heterotrimeric kinesin-2와 결합하는 결합단백질에 대하여서는 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 KIF3A의 C-말단 영역과 결합하는 단백질을 효모 two-hybrid system을 사용하여 탐색한 결과, brain expressed X-linked 2 (Bex2)를 분리하였다. Bex2는 KIF3A의 cargo-binding domain (CBD)을 포함하는 C-말단 영역과 결합하지만, KIF3B와 kinesin-1의 motor 단백질인 KIF5A와는 결합하지 않았다. 그리고 KIF3A는 Bex2의 다른 isoform인 Bex1과는 결합하지만, Bex3와는 결합하지 않았다. KIF3A은 GST-Bex1, GST-Bex2와는 결합하지만 GST와는 결합하지 않았다. HEK-293T세포에 Bex2을 발현시켰을 때 Bex2와 KIF3A는 세포 내의 같은 부위에 발현하며, Bex2 그리고 KIF3A을 면역침강한 결과 KIF3A와 KIF3B도 같이 침강함을 확인하였다. 이러한 결과들은 Bex2는 heterotrimeric kinesin-2와 운반체를 매개하는 단백질로의 가능성을 시사한다.
치수 생활력 검사시 전통적인 방법으로 전기치수검사나 온도변화검사 등이 있다. EPT와 ice test 즉, 전기치수검사와 온도변화검사는 치아의 신경학적 반응에 의해 치아의 실활여부를 판단하는 방법으로 환자가 아동일때는 정확한 반응을 얻기가 어렵고, 환자의 주관적 반응을 판단해야 하므로 객관적이지 못하고, 소아 환자에게 좋지 못한 자극을 주어 행동 조절의 문제를 일으키며, 거짓 양성반응과 거짓 음성반응이 나을 수 있다는 등의 한계가 있다. 최근에는 전통적인 방법의 한계를 극복하려는 시도에서 혈관의 보전성을 평가하는 방법인 laser doppler flowmetry와 pulse oximeter를 이용하는 방법이 소개되고 있다. Pulse oximeter의 원리는 두 가지 종류의 파장의 빛을 귀, 손가락등 생체의 말단에 투과시켜 발산된 빛과 감지된 빛간의 두 파장의 흡수비로 산소 포화 정도를 알아내는 것으로서 이에 착안하여 또 하나의 생체 말단인 치아에 이를 적용하여 치아의 실활 여부를 판단하는 것이다. 이 보고에서는 치수 생활력 검사시 pulse oximeter의 사용 가능성에대해 검증하고 이의 임상적용에 대해 기초적 자료를 제공하고자 함을 목적으로 했는데 생활치 에서는 평균 96.3%의 산소 포화도를 실활치에서는 평균 0.0%의 산소 포화도를 얻어냄으로서 pulse oximeter가 치아의 실활여부 판단에 있어 유용한 진단도구로서의 가치가 있다는 것이 밝혀졌다.
본 연구의 목적은 누에형질전환 기술과 피브로인 재조합단백질 발현시스템을 이용하여 청색형광실크를 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 피브로인 H-chain의 N-말단과 C-말단을 이용하여 피브로인 재조합단백질 발현 시스템을 제작하였고, 종결코돈이 없는 EBFP 유전자를 위의 발현 시스템에 클로닝하여 청색형광실크를 제작하였다. 누에형질전환체 선발을 위해서는 $3{\times}P3$ promoter와 DsRed2를 이용하여 선발하였고, 300개의 누에알에 microinjection하여 F1 세대에서 5 bloods의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 DsRed2 형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 실크의 피브로인에서 EGFP 단백질이 발현되는 것을 확인하기 위해, F2 세대의 누에형질전환체 중에서 5령 3일 유충을 해부하여 견사선을 형광현미경으로 관찰하였고, 중부 견사선에서 청색형광단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 F2 세대의 고치와 저온에서 정련한 실크에서도 청색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었고, Western blot 분석에서도 EBFP 재조합 단백질이 피브로인 H-chain과 융합된 형태로 존재하는 것이 확인되었다. 이상의 결과에서 청색형광실크를 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었고 이러한 결과를 토대로 새로운 산업소재로서 실크를 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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