• KSBB Journal
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• 제23권5호
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• pp.369-374
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• 2008

Rhdotorula glutinis epoxide hydrolase 유전자를 pColdI 벡터 와 pET-21b(+) 벡터에 재조합하여 제작한 E. coli를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide에 대하여 회분식 가수분해 반응을 실시하였다. pET-21b(+)/RgEH 재조합 플라스미드 DNA를 가진 E. coli를 $15^{\circ}C$에서 저온 배양할 때 수용성 단백질 형태로 가장 많이 발현되었고, 입체선택적 가수분해 활성과 촉매 안정성이 가장 좋았다. 라세믹 styrene oxide 20 mM에 대하여 반응온도 $30^{\circ}C$에서는 반응시간 20분 동안에 수율 24.0%로 (S)-styrene oxide를 얻은 반면에, 반응온도를 $10^{\circ}C$로 낮추고 0.5% (w/v) Tween 20을 첨가하고 반응시키면 광학순도 99.0% ee 이상의 (S)-styrene oxide을 46.0%의 수율로 얻을 수 있었다. 최적조건에서 E 값은 6.68이었으며, 100 mM의 라세믹 styrene oxide에 대해서는 반응시간 50분에 이론 수율 50% 대비 40%의 높은 수율로 (S)-styrene oxide를 얻을 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제15권6호
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• pp.630-634
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• 2000

에폭사이드 가수분해효소 활성이 우수한 Aspergillus niger 를 생촉매로 이용하여 업체선택적 가수분해 반응을 통해 라세믹 styrene oxide 기질로부터 광학활성 (S)-styrene oxide를 생산하는 실험을 수행하였다. (R)-styrene oxide 이성질체에 대한 초기 가수분해 속도에 영향을 주는 실험인자들인 pH, 반응온도, cosolvent 첨가량 등에 대해 중심합성계획법을 이용한 반응표면 분석을 통해 가수분해반응 속도를 향상시킬 수 있는 최적 반응조건을 결정하였다. pH 7.78, 반응온도 2 $28.32^{\circ}C$ 및 cosolvent 첨가량 2.4% (v/v)의 조건에서 약 10시간 정도의 반응을 통해 ee 값이 100%인 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 35% 정도(이론수율 = 50%)의 높은 수율로 얻을 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제18권1호
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• pp.136-142
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• 2008

Rhodotorula glutinis epoxide hydrolase (EH) 유전자를 pPICZ vector에 이중발현 cassette로 재조합하여 발현시킨 재조합균주 Pichia pastoris를 제작하였으며 라세믹 styrene oxide 혼합물로부터 고순도 광학활성 (S)-styrene oxide를 제조하는데 사용하였다. 본 연구에서 사용된 R. glutinis EH 유전자는 전보에서 사용한 pPICZ B/RgEH plasmid DNA를 주형으로 하여 얻었으며 PCR 방법으로 BglII 제한자리를 돌연변이 시키고 AOX1 promoter $(P_{AOX1})$-RgEH 유전자-전사종결서열($TT_{AOX1}$)을 이중으로 가진 이중발현 cassette를 만들어 P. pastoris의 염색체 DNA에 삽입시켰다. 반응온도를 $30^{\circ}C$로 하였을 때, RgEH를 이중발현 cassette로 발현시킨 재조합균주 P. pastoris의 (R)-styrene oxide에 대한 $V_{max}$ 값은 $2.2{\mu}mol\;min^{-1} (mg\;dcw)^{-1}$으로 단일발현 cassette로 발현시킨 P. pastoris의 $0.4{\mu}mol\;min^{-1}(mg\;dcw)^{-1}$에 비하여 6배 향상되었다. 광학순도가 높은 (S)-styrene oxide를 제조하는 최적조건을 찾기 위하여 입체선택적 가수분해 속도 및 수율에 미치는 detergent 및 온도의 효과를 실험하였으며, Tween 20을 0.5% 첨가하고 $10^{\circ}C$로 반응시킨 경우 10분 반응을 통해 99.9% ee 이상의 고순도 (S)-styrene oxide를 43.4% 얻을 수 있었다.

• 공업화학
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• 제19권5호
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• pp.491-496
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• 2008

해양 어류인 Mugil cephalus로부터 에폭사이드 가수분해효소(epoxide hydrolase, EH) 유전자를 PCR을 이용하여 클로닝하고, pColdI 및 pET-21b(+) 발현벡터에 삽입시켜 재조합 Escherichia coli 생촉매를 개발하여 각각에 대하여 가수분해 활성을 비교하였다. 재조합 E. coli 생촉매 $10mg\;dcw\;mL^{-1}$을 사용하여 20 mM 라세믹 styrene oxide를 입체선택적 가수분해를 한 결과, (R)-styrene oxide 기질에 대해서 입체선택성을 보였다. pET-21b(+)를 발현벡터로 사용하여 M. cephalus의 EH 유전자를 저온 발현시킨 재조합 E. coli 생촉매를 사용하여, 약 40 min 반응을 통해 광학순도 99% ee (enantiomeric excess) 이상인 (S)-styrene oxide를 최종 수율 24.5% (이론수율 50%)로 제조할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권7호
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• pp.1032-1040
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• 2006

Some Pseudomonas species can grow on styrene as a sole carbon and energy source. From the new isolate Pseudomonas putida SN1, the genes for styrene catabolism were cloned and sequenced. They were composed of four structural genes for styrene monooxygenase (styA and styB), styrene oxide isomerase (styC), and phenylacetaldehyde dehydrogenase (styD), along with two genes for the regulatory system (styS and styR). All the genes showed high DNA sequence (91% to 99%) and amino acid sequence (94% to 100%) similarities with the corresponding genes of the previously reported styrene-degrading Pseudomonas strains. A recombinant Escherichia coli to contain the styrene monooxygenase from the SN1 was constructed under the control of the T7 promoter for the production of enantiopure (S)-styrene oxide, which is an important chiral building block in organic synthesis. The recombinant E. coli could convert styrene into an enantiopure (S)-styrene oxide (ee >99%) when induced by IPTG The maximum activity was observed as 140 U/g cell, when induced with 1 mM IPTG at $15^{\circ}C$.

• 생명과학회지
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• 제12권6호
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• pp.765-768
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• 2002

Rhodotorula sp. CL-82 유래 의 epoxide hydrolase 활성을 이용하여 라세믹 styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. Rhodotorula sp. CL-82 생촉매의 입체선택적 가수분해속도를 나타내주는 반응표면 곡선에 대한 분석을 통해 pH, 반응주도, cosolvent 첨가량에 대한 최적조건을 각각 7.6,$33.3^{\circ}C$ , 3%(v/v)으로 결정하였다. 최적반응조건에서 약 4시간 정도의 반응을 통해 ee값이 99% 이상인 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 이론 수율대비 40% 수율로 얻을 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제12권5호
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• pp.584-588
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• 2002

Apergillus niger LK의 epoxide hydrolase 활성을 이용하여 chiral styrene oxide를 제조할 수 있는 hollow-fiber 반응기 기반의 비대칭 분할 시스템을 개발하였다. 라세믹 styrene oxide 기질을 dodecane 유기용매에 용해시켜 hollow-fiber 반응기의 lumen 부위로 공급하였으며, 생촉매인 A. niger LK 미세분말은 shell 부위로 공급함으로써 막 표면에서 비대칭 분할 반응을 수행하였다. 반응 산물로 생성되는 phenyl-1,2-ethandiol에 의한 epoxide hydrolase 활성 저해효과를 감소시키기 위하여 2번째 hollow-fiber 반응기에서 완충용액을 이용하여 diol을 추출하여 제거시켰다. 2성분 용매를 사용한 cascade형 hollow-fiber 반응기 시스템을 이용하여 광학적으로 순수한 (ee > 99%) (5)-styrene oxide를 19.5% (이론 수율 대비 39%)의 수율로 얻을 수 있었다.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제11권6호
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• pp.530-537
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• 2006

Recently isolated, Pseudomonas putida SN1 grows on styrene as its sole carbon and energy source through successive oxidation of styrene by styrene monooxygenase (SMO), styrene oxide isomerase (SOI), and phenylacetaldehyde dehydrogenase. For the production of (S)-styrene oxide, two knockout mutants of SN1 were constructed, one lacking SOI and another lacking both SMO and SOI. These mutants were developed into whole-cell biocatalysts by transformation with a multicopy plasmid vector containing SMO genes (styAB) of the SN1. Neither of these self-cloned recombinants could grow on styrene, but both converted styrene into an enantiopure (S)-styrene oxide (e.e. > 99%). Whole-cell SMO activity was higher in the recombinant constructed from the SOI-deleted mutant (130 U/g cdw) than in the other one (35 U/g cdw). However, the SMO activity of the former was about the same as that of the SOI-deleted SN1 possessing a single copy of the styAB gene that was used as host. This indicates that the copy number of styAB genes is not rate-limiting on SMO catalysis by whole-cell SN1.

• 공업화학
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• 제18권3호
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• pp.279-283
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• 2007

한 종류의 epoxide hydrolase (EH) 효소 자체가 광학수렴 가수분해(enantioconvergent hydrolysis) 활성을 가지는 Caulobacter crescentus의 epoxide hydrolase (CcEH) 유전자를 PCR로 클로닝하여 재조합시킨 Escherichia coli 생촉매를 개발하였다. 재조합 E. coli 세포 10 mg을 10 mM styrene oxide와 반응시킨 다음 기질과 반응생성물을 chiral GC와 HPLC로 각각 분석 한 결과, (S)-styrene oxide 기질에 대해서는 위치 선택적으로 에폭사이드 링의 ${\alpha}$-탄소를 공격하여 (R)-diol로 전환시켰다. 반면에 (R)-styrene oxide에 대하여는 ${\beta}$-탄소를 공격하여 (R)-diol로 전환시키는 위치선택성을 가지고 있었다. 재조합 CcEH를 단일 생촉매로 사용한 광학수렴 가수분해반응을 통해 20 mM racemic styrene oxide에 대하여 광학순도 85%의 (R)-phenyl-1,2-ethanediol을 수율 69%로 생합성 할 수 있었다

• 공업화학
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• 제17권5호
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• pp.557-560
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• 2006

Aspergillus niger LK의 epoxide hydrolase (EH)를 codon usage를 고려한 Escherichia coli 균주에서 고효율로 발현할 수 있었다. E. coli에서 잘 사용되지 않는 rare codon에 대한 tRNA 유전자 정보가 들어있는 plasmid를 함유한 E. coli 균주인 Rosetta (DE3)PLysS를 숙주세포로 사용하였다. A. niger EH를 발현시킨 재조합 E. coli를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 혼합물과 반응시켰을 때, (R)-styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해활성이 향상됨을 확인할 수 있었다. 또한 라세믹 기질로부터 입체적으로 고순도인 99% ee 값을 갖는 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 얻을 수 있었다.