• 식물병연구
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• 제12권3호
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• pp.205-212
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• 2006

2002년에서 2005년 동안 경북김천, 천안, 경기지역의 포도재배지로부터 채집한 300여점의 포도 혹병반으로부터 A. vitis의 PCR 특이검출 Phe A primer를 이용하여 포도혹병균의 대량분리를 실시하여 0.25kb의 PCR 특이밴드가 증폭된 51균주가 포도 혹병균으로 선발되었다. 이 균주들을 Ti-Plasmid 유래의 Vir A primer로 적용한 결과 40균주에서 0.5kb의 특이밴드가 검출되었다. 거봉포도와 당근절편에서 다양한 양상의 병원성을 보였으며 25균주가 거봉포도에 강한 병원성을 나타내었으며, 다른 균주는 약하거나 비 병원성을 보였다. 본 연구에서 분리한 10개 균주를 대상으로한 세균의 이화학적 특성은 균주간에 약간은 달랐으나, 3-Ketolactose의 비생성, 2%NaC 첨가 배지에서의 성장, Melezitose로부터의 산을 생성하지 못하는 등 비교균주와 대체적으로 일치하는 경향을 보였다. 따라서, PheA and Vir A primer를 이용하여 Agrobacterium vitis 균주를 대량 분리할 수 있으며 신속, 정확하게 동정할 수 있을 것으로 생각되었다.

• 생명과학회지
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• 제25권6호
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• pp.631-637
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• 2015

Streptmyces avidinii에서 발현되는 Streptavidin은 vitamin H인 d-biotin 4분자에 결합하며 해리상수(Kd)가 10⁻¹⁵ M를 나타내는 아주 강한 비공유결합이다. 이러한 streptavidin과 biotin 상호간의 강한 결합력은 수많은 생물체 분자들의 탐지 및 특징을 연구하는데 응용되어져 왔으므로 Escherichia coli에서 수용성 streptavidin의 기능적 발현에 대한 연구는 매우 유용하다. 즉 Escherichia coli에서 streptavidin을 발현시키기 위해 streptavidin유전자를 T7 RNA polymerase/T7 promoter를 이용하는 pET-22b 플라스미드로 클로닝하였다. 또한 N-말단에 pelB leader를 포함하여 발현된 streptavidin의 periplasmic space로 운반하여 수용성 단백질형태의 분비를 촉진하였으며 C-말단에는 6개의 polyhistidine tags를 두어 정제하는데 사용되었다. 정제된 streptavidin단백질은 10-20 mg/ml 의 높은 회수율을 나타내었으며 SDS-PAGE에서 가열하는 경우 변성되어 17 kD인 monomer형태를, 가열하지 않는 경우에는 68 kDa으로 원래의 tetramer형태를 나타내었다. 따라서 streptavidin의 tetramer 구조는 비공유결합에 의해 이루어짐을 알 수 있었다. Size-exclusion chromatography에 의한 streptavidin의 구조 역시 tetramer를 재확인할 수 있었다. 정제된 수용성 streptavidin은 Westernblot실험에서 biotinylation된 단백질을 탐지하였으며 이 결과는 정제된 streptavidin이 biotin에 결합하는 기능이 존재함을 나타내었다. 이상의 모든 결과를 종합해보면 본 연구에서 구축된 발현시스템을 통하여 발현된 streptavidin은 높은 회수율을 나타내어 대량생산이 가능하였으며 자연상태의 streptavidin과 동일한 homotetramer를 형성하고 biotin에 결합할 수 있는 기능을 나타내었다.

• 식물병연구
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• 제19권1호
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• pp.36-44
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• 2013

카네이션은 세계 3대 절화용 화훼작물의 하나로, 농가 생산액 210억 원에 이르는 주요작물이다. 이들은 절화, 종자, 묘 및 삽수의 4 품목으로 수출입 되고 있다. 카네이션과 같은 영양번식성 작물의 경우, 증식하는 과정 중에 바이러스의 확산과 전파가 용이한데, 우리나라에서는 카네이션괴저바이러스(CNFV)와 카네이션둥근반점바이러스(CRSV)를 식물검역 바이러스로 지정하여 수입검사를 수행하고 있다. 본 연구에서는 CNFV와 CRSV를 신속, 정밀하고 쉽게 진단할 수 있는 특이적인 프라이머를 고안하였으며, 높은 검출 감도를 가지는 nested 프라이머 조합을 개발하였다. CNFV를 검사하기 위해 최종 선발된 특이적인 프라이머는 2 세트로 288과 447 bp를, CRSV를 검사하기 위해 최종 선발된 특이적인 프라이머는 2 세트로 503과 549 bp를 증폭하였다. CNFV의 nested는 2 세트 모두 147 bp로 동일하며, CRSV는 각각 395와 347 bp의 밴드를 증폭하였다. 또한, 실험의 신뢰도를 높이기 위하여, 증폭산물에 염기서열 6개를 삽입한 플라스미드를 제작하여 양성대조구로 활용하였다. 본 연구에서 개발한 방법은, 향후 CNFV와 CRSV에 대한 신속, 정밀한 국경검역을 지원할 수 있을 것이라고 기대된다.

• 대한환경공학회지
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• 제27권5호
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• pp.507-512
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• 2005

본 연구에서는 유전자 재조합 발광균주, Pseudomonas putida mt-2 KG1206을 이용하여 토양에 오염된 m-toluate 탐지 방법 및 적용 가능성에 대해 조사하였다. KG1206은 톨루엔 계열 화합물의 중요 중간 분해물질인 m-toluate 및 benzoate가 직접 생물 발광 유도제로 작용하며, 또한 톨루엔 계열 화합물들이 간접 유도제로서 발광 활성을 나타내었다. 토양에 오염된 유도제 오염원 검출을 위해 발광 균주 9.9 mL에 에탄올 추출물 0.1 mL을 첨가하여 조사하였다. 생물발광에 근거하여 작성된 m-toluate 검량선은 대략 $R^2>0.97$ 이상의 상관관계가 관찰되었다. 토양에 임의 오염된 m-toluate(직접 발광유도제)는 정립한 방법에 따라 발광활성에 근거하여 추측하였고, 기기분석치와 통계적으로 유의한 것으로 조사되었다. 본 연구 결과를 통해서 특정 화합물에 대해 발광을 생산하는 유전자 재조합 균주가 특정 오염원에 오염된 지역의 관리를 위한 수단으로 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제20권12호
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• pp.1896-1901
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• 2010

본 연구는 가축생균제용 유산균을 Real-time PCR정량분석법을 이용하여 분석하였다. SYBR Green1 방법과 Probe 방법을 이용하여 표준곡선을 제작한 결과, SYBR Green1 방법에서는 Slope 값이 -3.346이었고, Y절편은 33.18, $R^2$ 값은 0.993으로 나타났으며, Probe 방법에서는 Slope값이 -3.321이었고, Y절편은 39.10, $R^2$ 값은 0.995로 나타나, 이를 이용한 표준곡선 제작이 가능함을 알 수 있었다. SYBR Green1 방법을 이용한 생균제의 Lactobacilli 정성 정량 분석결과 Real-time PCR값은 4.46~6.56 log copies로 나타났고, 생균수 측정 결과 값은 5.63~7.59 log CFU/g로 나타났으며, Probe 방법을 이용한 생균제의 Lactobacilli 정성 정량 분석결과에서는 Real-time PCR 값은 5.51~7.00 log copies로 나타났으며, 생균수 측정 결과 값은 5.63~7.59 log CFU/g로 나타났다. 본 연구에서 실시한 RT PCR법은 3~4일이 소요되는 기존의 배지법과 비교하여 24시간 이내에 신속하게 검출이 가능하다고 여겨지며, 또한 RT PCR을 이용한 분석방법에서도 dye 사용과 primer 사용에 따라 결과값이 차이가 나타났음을 확인할 수 있었으며, Probe 방법을 이용하여 실험 한 결과가 민감한 결과를 나타내었음을 확인 할 수 있었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제37권4호
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• pp.528-533
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• 2008

국내 유통 중인 우육 및 돈육을 대상으로 S. aureus의 오염실태와 검출된 S. aureus 대한 항생제 감수성조사 및 내성 plasmid 전달빈도를 조사하였다. 총 421개 축산물 시료의 20.2%에서 S. aureus가 검출되었으며, 품목별로는 돈육 13.9%, 우육 33.8%의 검출률을 보였다. 가공 전 원료육이 포장육에 비해 S. aureus의 검출률이 높았는데, 돈육에서는 원료육 23.3%, 포장육 7.1%였고, 우육에서는 각각 48.6% 및 28.1%였다. 항생제 감수성 시험결과 ampicillin(76.5%), penicllin(75.3%), tertracycline(27.1%) 및 erythromycin (21.1%) 순으로 높은 내성률을 보였다. 특히 우육에서는 penicillin의 내성이 55.6%인 반면 돈육에서는 97.5%로 돈육에서 1.6배 이상의 높은 내성률을 보였고, tetracycline의 경우 우육에서 13.3%의 내성을 보인 반면, 돈육에서는 42.5%로 3배 이상의 내성률을 보였다. 8가지 항생제에 내성을 보이는 다제내성균도 검출되었으며, 약제내성과 관련된 Rplasmid의 특성시험에서 혼합배양에서는 내성이 전달되지 않았고, filter mating법에서 tetracycline내성 plasmid가 $1.1{\times}10^{-5}{\sim}1.9{\times}10^{-9}$의 빈도로, erythromycin 내성 plasmid가 $1.2{\times}10^{-5}{\sim}4.0{\times}10^{-8}$ 빈도로 내성이 전달되었다. 따라서 국내에서는 항생제투입의 정량적인 규제나 법적인 제도장치의 마련이 시급하다고 생각되며 앞으로 항생제 사용규제 및 대책마련에 대한 추가적인 연구가 절실하다고 생각되었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제39권2호
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• pp.171-176
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• 2001

Western blot analysis was performed to diagnose vivax malaria using stage-specific recombinant antigens. Genomic DNA from the whole blood of a malaria patient was used as templates to amplify the coding regions for the antigenic domains of circumsporozoite protein (CSP-1), meroxoite surface protein (MSP-1), apical merozoite antigen (AMA- 1), serine repeat antigen (SERA), and exported antigen (EXP- 1) of Plasmodium vivax. Each amplified DNA fragment was inserted into a pGEX-4T plasmid to induce the expression of GST fusion protein in Escherichia coli by IPTG. The bacterial cell extracts were separated on 10% SDS-PAGE followed by western blot analysis with patient sera which was confirmed by blood smear examination. When applied with patient sera, 147 (91.9%) out of 160 vivax malaria, 12 (92.3%) out of 13 falciparum malaria, and all 9 vivax/falciparum mixed malaria reacted with at least one antigen, while no reactions occurred with 20 normal uninfected sera. In the case of vivax malaria, CSP-1 reacted with 128 (80.0%) sera, MSP-1 with 102 (63.8%), AMA-1 with 128 (80.0%), SERA with 115 (71.9%), and EXP-1 with 89 (55.6%), respectively. We obtained higher detection rates when using S antigens (91.9%) rather than using each antigen solely (55.6 - 80%), a combination of 2 (76.3 - 87.5%), 3 (85.6 - 90.6%), or 4 antigens (89.4 - 91.3%). This method can be applied to serological diagnosis, mass screening in endemic regions, or safety test in transfusion of prevalent vivax malaria.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제17권6호
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• pp.743-749
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• 2004

The gene encoding human serum albumin (HSA) was cloned from human liver cDNA library by PCR. The HSA cDNA in size of 2,176 bp, including 1,830 bp of open reading frame, was cloned into the plasmid carried with the 5'flanking sequence of goat $\beta$-casein gene (-4,044 to +2,025 bp) to get a tissue specific expression vector in mammary gland named pGB562/HSA (12.5 kb). A 9.6 kb DNA fragment in which the sequence is in order of goat $\beta$-casein gene regulatory sequence, HSA cDNA and SV40 polyadenylation signals was isolated from the pGB562/HSA by SacI and DraIII cutting, and used to microinject into the pronuclei of mouse fertilized eggs to produce transgenic mice. Three transgenic mice (2 female and 1 male) were identified by PCR and dot Southern blot analysis. The copy numbers of integrated transgene were more than 10 copies in line #21 and #26 as well as over 50 copies in line #31 of transgenic mice. HSA protein collected from the milk of lactating transgenic mice was confirmed by immuno-detection of Western and slot blot. The concentrations of HSA in the milk were from 0.05 to 0.4 mg/ml. An obvious antigen and antibody conjugate could be observed in immunohistochemical stain of mammary gland tissue from lactating day 11 of HSA transgenic mice. The transmission of transgene and its expression was recognized according to the results of RT-PCR and sequences analyses of their progeny.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권7호
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• pp.1154-1162
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• 2015

The emergence of carbapenem resistance among Pseudomonas aeruginosa is an increasing problem in many parts of the world. In particular, metallo-$\beta$-lactamases (MBLs) and AmpC $\beta$lactamases are responsible for high-level resistance to carbapenem and cephalosporin. We studied the diversity and frequency of $\beta$-lactamases and characterized chromosomal AmpC $\beta$lactamase from carbapenem-resistant P. aeruginosa isolates. Sixty-one carbapenem-resistant P. aeruginosa isolates were collected from patients in a tertiary hospital in Daejeon, Korea, from January 2011 to June 2014. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of four antimicrobial agents were determined using the agar-dilution method. Polymerase chain reaction and sequencing were used to identify the various $\beta$-lactamase genes, class 1 integrons, and chromosomally encoded and plasmid-mediated ampC genes. In addition, the epidemiological relationship was investigated by multilocus sequence typing. Among 61 carbapenem-resistant P. aeruginosa isolates, 25 isolates (41.0%) were MBL producers. Additionally, 30 isolates producing PDC (Pseudomonas-derived cephalosporinase)-2 were highly resistant to ceftazidime (MIC₅₀ = $256{\mu}g/ml$) and cefepime (MIC₅₀ = $256{\mu}g/ml$). Of all the PDC variants, 25 isolates harboring MBL genes showed high levels of cephalosporin and carbapenem resistance, whereas 36 isolates that did not harbor MBL genes revealed relatively low-level resistance (ceftazidime, p < 0.001; cefepime, p < 0.001; imipenem, p = 0.003; meropenem, p < 0.001). The coexistence of MBLs and AmpC $\beta$-lactamases suggests that these may be important contributing factors for cephalosporin and carbapenem resistance. Therefore, efficient detection and intervention to control drug resistance are necessary to prevent the emergence of P. aeruginosa possessing this combination of $\beta$-lactamases.

• 한국동물위생학회지
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• 제29권3호
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• pp.277-285
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• 2006

Plasmids are covalently closed circular molecules of DNA that are stably inherited and replicate somewhat independently of the bacterial chromosome. Genes carried on plasmids can mediate a wide variety of important functions, including antibiotics (R plasmids) and heavy metals resistance, toxins production, cell penetration, iron chelation, complement resistance, and metabolic characteristics such as sucrose and lactose fermentation. Fifty strains of lactobacilli were isolated from 26 staters and 29 fermented milk products. They were classified 27 strains as Lactobacillus paracasei subsp paracasei, 11 stains as Lactococcus lactis subsp cremoris, 6 strains as L delbrueckii subsp lactis, 4 strains as L acidophius, and 2 strains as L delbrueckii subsp bulgaricus. All of these strains were examined for drug resistance and transferability of R plasmids. All of the isolates were sensitive to Am, C, CF, E, NB, P, T, and Te. But resistant to SXT 94% (47 strains), K 66% (33 strains), S 56% (28 strains), ENR 50% (25 strains), NOR 38% (19 strains) CIP 38% (19 strains), GM 16% (8 strains), and N 14% (7 strains), in order. And 32 different resistant patterns were found. The most frequently encountered patterns were CIP-ENR-K-NOR-S-SXT (5 strains). In vitro R plasmids transfer experiment, 57 antibiotic resistant strains which were not transfer to the recipient 2 Escherichia coli strains by conjugation, These results indicate that Lactobacillus in internal trade market' stater recognize R factor but transmissible R plasmid is not existed.