• BMB Reports
• /
• 제40권5호
• /
• pp.723-730
• /
• 2007

Kinesin is an ATP-driven microtubule motor protein that plays important roles in control of microtubule dynamics, intracellular transport, cell division and signal transduction. The kinesin superfamily is composed of numerous members that are classified into 14 subfamilies. Animal kinesins have been well characterized. In contrast, plant kinesins have not yet to be characterized adequately. Here, a novel plant-specific kinesin gene, GhKCH2, has been cloned from cotton (Gossypium hirsutum) fibers and biochemically identified by prokaryotic expression, affinity purification, ATPase activity assay and microtubule-binding analysis. The putative motor domain of GhKCH2, $M_{396-734}$ corresponding to amino acids Q396-N734 was fused with 6$\times$His-tag, soluble-expressed in E. coli and affinity-purified in a large amount. The biochemical analysis demonstrated that the basal ATPase activity of $M_{396-734}$ is not activated by $Ca^{2+}$, but stimulated 30-fold max by microtubules. The enzymatic activation is microtubule-concentration-dependent, and the concentration of microtubules that corresponds to half-maximum activation was about 11 ${\mu}M$, much higher than that of other kinesins reported. The cosedimentation assay indicated that $M_{396-734}$ could bind to microtubules in vitro whenever the nucleotide AMP-PNP is present or absent. As a plant-specific microtubule-dependent kinesin with a lower microtubule-affinity and a nucleotide-independent microtubule-binding ability, cotton GhKCH2 might be involved in the function of microtubules during the deposition of cellulose microfibrils in fibers or the formation of cell wall.

• BMB Reports
• /
• 제40권1호
• /
• pp.44-52
• /
• 2007

Kinesins, as a kind of microtubule-based motor proteins, have a conserved microtubule-binding site in their motor domain. Here we report that two homologous kinesins in Arabidopsis thaliana, KatB and KatC, contain a second microtubule-binding site in their tail domains. The prokaryotic-expressed N-terminal tail domain of the KatC heavy chain can bind to microtubules in an ATP-insensitive manner. To identify the precise region responsible for the binding, a serious of truncated KatC cDNAs encoding KatC N-terminal regions in different lengths, KatC1-128, KatC1-86, KatC1-73 and KatC1-63, fused to Histidine-tags, were expressed in E. coli and affinity-purified. Microtubule cosedimentation assays show that the site at amino acid residues 74-86 in KatC is important for microtubule-binding. By similarity, we obtained three different lengths of KatB N-terminal regions, KatB1-384, KatB1-77, and KatB1-63, and analyzed their microtubule-binding ability. Cosedimentation assays indicate that the KatB tail domain can also bind to microtubules at the same site as and in a similar manner to KatC. Fluorescence microscopic observations show that the microtubule-binding site at the tail domain of KatB or KatC can induce microtubules bundling only when the stalk domain is present. Through pull-down assays, we show that KatB1-385 and KatC1-394 are able to interact specifically with themselves and with each other in vitro. These findings are significant for identifying a previously uncharacterized microtubule-binding site in the two kinesin proteins, KatB and KatC, and the functional relations between them.

• 생명과학회지
• /
• 제27권6호
• /
• pp.673-679
• /
• 2017

미세소관을 따라 이동하는 모터단백질들은 세포내 물질수송에 필수적인 역할을 한다. Kinesin 1은 세포내에서 미세소관을 따라 움직이는 모터단백질로서 다양한 소포, mRNA, 그리고 단백질의 세포내 수송에 관여한다. Kinesin 1은 2개의 장쇄단위체(KHCs, 또는 KIF5s)와 2개의 경쇄단위체(KLCs)로 구성되어 있다. KIF5s는 N-말단에 모터도메인을 가지고 있고 C-말단의 운반체 결합도메인을 통해 다양한 운반체와 결합한다. 본 연구에서 KIF5B와 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid 탐색을 수행한 결과 미세소관의 plus end 결합단백질인 cytoplasmic linker protein 170 (CLIP-170)을 분리하였다. CLIP-170의 coiled-coil 도메인은 KIF5B의 운반체 결합도메인과 결합하였다. 또한 CLIP-170은 KIF5A와 KIF5C와도 결합하였다. 그리고 glutathione S-transferase (GST) pull-down을 통해 KIF5s와 CLIP-170이 단백질수준에서 결합함을 확인하였다. 생쥐 뇌파쇄액을 KIF5B 항체로 면역침강한 결과 CLIP-170이 같이 침강함을 확인하였다. 이러한 결과들은 kinesin 1이 세포내에서 CLIP-170을 운반함을 시사한다.

• 생명과학회지
• /
• 제27권7호
• /
• pp.840-848
• /
• 2017

세포내 수송 기구는 세포의 작용과 생존에 필수적이다. 이러한 세포내 수송은 긴 미세소관을 따라서 운반체를 운반하는 미세소관 의존 분자 모터 단백질인 kinesin과 cytoplasmic dynein에 의하여 이루어진다. Kinesin은 ATP 의존적으로 미세소관의 plus-end방향으로 이동하는 모터 단백질로 세포내 소기관, 분비소포, RNA 복합체, 단백질 복합체들을 수송한다. Kinesins에 의한 다양한 운반체의 수송의 이상은 세포의 기능 이상과 연관된다. Kinesins에 의한 운반체 수송의 기본 단계는: 운반체 혹은 adaptor 단백질과의 결합, kinesin 기능 활성화와 미세소관을 따라서 이동, 그리고 올바른 위치에서 운반체와의 분리 단계로 나뉘어 진다. 최근의 연구결과들에서 kinesin 모터 기능 활성화, 운반체와의 결합, 운반체와의 해리 기전이 확인되고 있으며 세포내 운반체 수송은 kinesin과 운반체를 연결하는 adaptor 단백질에 의하여서도 조절된다. 단백질 인산화 효소, 탈 인산화 효소를 포함하는 kinesin 모터 활성 조절 단백질들은 kinesin의 인산화 혹은 탈 인산화를 통하여 직접적으로 세포내 수송을 조절하거나, c-Jun NH-terminal kinase-interacting proteins (JIPs)와 같은 adaptor 단백질들과 미세소관의 간접적 수식을 통하여 세포내 수송을 조절하기도 한다. 이러한 연구결과들은 세포의 기능과 형태 유지에 관여하는 kinesin에 의한 다양한 세포내 수송 조절 기전을 이해하는데 기초적인 토대가 된다. 또한 각각의 kinesin에 대한 조절 기전을 밝히는 것은 세포생물학과 신경생리학을 이해하는데 중요하므로 본 종설에서는 kinesin에 의한 세포내 수송을 조절하는 단백질과 kinesin과 수송체와의 결합이 어떻게 조절되는지를 고찰하고자 한다.

• 생명과학회지
• /
• 제19권7호
• /
• pp.859-865
• /
• 2009

미세소관은 세포골격단백질의 중요한 구성 단백질로 축삭돌기 내에서는 세포막 방향으로 정렬되어 있다. Kinesin superfamily (KIFs)는 세포 내에서 미세소관을 따라 세포 내 소포들을 운반하는 분자 자동차 (molecular motor) 단백질이다. 본 연구에서 우리는 효모 two-hybrid system을 사용하여 KIF1A의 coiled-coil 영역과 결합하는 단백질로 미세소관 불안정화 요소인 SCG10 단백질을 분리하였다. SCG10은 KIFs에서 KIF1A와만 특이적으로 결한 하며, KIF1A의 400에서 820아미노산 부위가 SCG10과의 결합에 필수적임을 효모 two-hybrid assay로 확인하였다. 또한 SCG10의 coiled-coil영역은 KIF1A와의 결합에 필수영역임을 확인하였으며 단백질간의 결합은 Glutathione S-transferase pull-down assay를 통하여 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액에 SCG10항체로 면역침강을 행하여 KIF1A를 확인한 결과KIF1A는 SCG10과 특이적으로 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 KIF1A는 SCG10와 결합하여 SCG10이 포함된 소포를 미세소관을 따라 이동시킴을 시사한다.

• 생명과학회지
• /
• 제21권8호
• /
• pp.1076-1082
• /
• 2011

미세소관(microtubule) 위를 이동하는 키네신은 분비소포를 이동시키는 운동단백질이다. KIF5s (KIF5A, KIF5B and KIF5C)는 세포막으로 싸인 각종 세포 내 소기관과 결합하여 미세소관을 따라 목적지까지 이동시킨다는 결과는 알려져 있지만, 어떻게 상대의 cargo를 인식하는지는 밝혀지지 않았다. 본 연구는 KIF5B의 결합 단백질을 동정하기 위하여 효모 two-hybrid system을 사용하여 KIF5B와 특이적으로 결합하는 Myo9b을 확인하였다. Myo9b는 액틴위를 이동하는 운동단백질로 다른 KIF5s들과도 결합함을 효모 two-hybrid assay로 확인하였다. 또한 Myo9s의 GTPase 활성화 단백질(GAP) 영역은 KIF5B와 결합하는데 필수영역임을 확인하였고, 이러한 단백질간의 결합은 Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay를 통하여서도 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액에 KIF5B들의 항체로 면역침강을 행하여 Myo9s 단백질을 확인한 결과, KIF5s는 Myo9s 단백질과 특이적으로 함께 침강하였다. 이러한 결과들은 kinesin-I는 액틴 결합 운동단백질과 직접 결합함을 보여준다.

• 미생물학회지
• /
• 제35권1호
• /
• pp.18-24
• /
• 1999

Kinesin은 Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans, Drosophila melanogaster 등에서 발견 되었으며 dynein 과 더불어 세포분열 과정중 chromosome 의 이동과 spindle pole 의 분리에 관련된 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 기존에 발견된 kinesin 유사 유전자의 homology 가 많은 motor domain을 이용하여 primer를 합성한 후 이를 이용하여 Schizosaccharomyces pombe 로부터 kinesin heavy chain 의 유전자를 클론하였다. 염기서열을 결정한 결과 2496 bp의 해독틀을 가지고 있으며 832개의 아미노산으로 이루어진 분자량이 96 kd의 kinesin heavy chain을 암호화하는 것이 밝혀졌다. 기존에 밝혀진 다른 organism 의 kinesin 과 서열을 비교한 결과 새로이 클론된 S.pombe 의 kinesin 은 C-terminal motor subfamily 에 속함이 밝혀졌다.

• 생명과학회지
• /
• 제26권8호
• /
• pp.963-969
• /
• 2016

Kinesin superfamily proteins (KIFs)은 세포 내 소기관이나 단백질복합체를 미세소관을 따라 운반하는 모터단백질이다. Kinesin 1은 경쇄단위체(light chain subunit)를 통하여 결합함으로써 세포 내 소기관, 신경소포, 신경전달물질수용체, 신호전달단백질, mRNA 등 다양한 운반체를 운반하는 KIFs의 한 종류이다. Kinesin light chains (KLCs)은 모터기능이 없는 단위체로서 kinesin heavy chains (KHCs) 이량체와 결합하여 kinesin 1을 구성한다. KLCs은 여러 단백질과 결합하지만 아직 결합단백질이 충분히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 KLC1의 tetratricopeptide repeat (TPR) 영역과 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid 탐색을 수행한 결과 Wiskott-Aldrich syndrome의 원인단백질이며 액틴 세포골격 조절단백질인 WASP/WAVE family의 하나인 WAVE1을 분리하였다. WAVE1은 KLC1의 TPR 영역을 포함한 부위와 결합하지만 KHCs인 KIF5A, KIF5B, KIF5C와는 결합하지 않았다. 또한 KLC1은 WAVE1의 C-말단에 존재하는 verprolin/cofilin/acidic (VCA) 도메인과 결합하였으며, 다른 WAVE isoform인 WAVE2와 WAVE3과도 결합하였다. HEK-293T 세포에 WAVE1과 KLC1을 동시에 발현시켰을 때 두 단백질이 세포 내에서 같은 부위에 존재하며, WAVE1을 면역침강한 결과 KLC1뿐만 아니라 KIF5B가 같이 침강함을 확인하였다. 이러한 결과들은 kinesin 1이 WAVE 단백질복합체 혹은 WAVE로 덮여있는 운반체를 운반함을 시사한다.

• 생명과학회지
• /
• 제29권3호
• /
• pp.369-375
• /
• 2019

미세소관은 알파- 와 베타-tubulin의 이량체가 종합되어 형성되며, 또한 세포내에서 tubulin 수송은 섬모나 편모와 같은 세포 부착 기관의 성장에 중요한 역할을 한다. Kinesin 2는 kinesin superfamily (KIF)의 분자 모터 단백질의 한 종류로 미세소관를 따라 다양한 운반체를 운반하며, 2종류의 다른 모터 단백질(KIF3A, KIF3B)과 kinesin-associated protein 3 (KAP3)로 구성되어 있다. Kinesin 2는 KIF3A의 cargo binding domain을 통하여 다양한 단백질과의 결합이 알려져 있지만, 아직 결합단백질의 다수는 아직 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 KIF3A와 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid system을 사용하여 탐색한 결과 미세소관의 단위체의 한 종류인 ${\beta}2-tubulin$ type (Tubb2)을 분리하였다. Tubb2는 KIF3A와 결합하지만, KIF3B, KIF5B와 kinesin light chain 1 (KLC1)과는 결합하지 않았다. Tubb2의 C-말단은 KIF3A와의 결합에 필요하며, 다른 KIF3A는 Tubb의 isoforms인 Tubb1, Tubb2, Tubb3, Tubb4, Tubb5와도 결합하였다. 그러나 Tuba1은 KIF3A와 결합하지 않았다. 생쥐의 뇌 파쇄액을 KIF3A 항체로 면역침강한 결과 Tubb2는 heterotrimeric kinesin 2의 구성단백질들과 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 heterotrimeric kinesin 2는 tubulin과 결합하여 세포 내에서 tubulins을 운반하는 것을 시사한다.

• Molecules and Cells
• /
• 제43권8호
• /
• pp.705-717
• /
• 2020

While the growth factors like insulin initiate a signaling cascade to induce conformational changes in the mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), amino acids cause the complex to localize to the site of activation, the lysosome. The precise mechanism of how mTORC1 moves in and out of the lysosome is yet to be elucidated in detail. Here we report that microtubules and the motor protein KIF11 are required for the proper dissociation of mTORC1 from the lysosome upon amino acid scarcity. When microtubules are disrupted or KIF11 is knocked down, we observe that mTORC1 localizes to the lysosome even in the amino acid-starved situation where it should be dispersed in the cytosol, causing an elevated mTORC1 activity. Moreover, in the mechanistic perspective, we discover that mTORC1 interacts with KIF11 on the motor domain of KIF11, enabling the complex to move out of the lysosome along microtubules. Our results suggest not only a novel way of the regulation regarding amino acid availability for mTORC1, but also a new role of KIF11 and microtubules in mTOR signaling.