고정화 지지체로 사용된 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 작용기를 부착시켜 기능성을 부가한 후 효소인 리파아제를 고정화하여 리파아제의 안정성을 향상시키고자 연구를 수행하였다. 지지체에 부착하는 작용기가 고정화된 효소의 활성과 안정성에 미치는 영향도 살펴보았다. 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 부착한 작용기인 epoxy group과 amine group은 glycidyl methacrylate과 aminopropyl triethoxysilane을 통해 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자 표면에 각각 부착하였다. 작용기가 부착된 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 고정화한 Candida rugosa lipase는 자유효소에 비해 초기반응속도는 다소 낮았지만, 3 회 재사용한 후 측정한 활성이 최초 활성 대비 92 % 이상의 활성을 유지하였다. 또한, 실리카 코팅된 자성 나노입자에 glutaraldehyde를 이용한 cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 방법과 공유결합법을 통해 라파아제를 각각 고정화한 연구를 수행한 결과, 실리카 나노입자와 실리카 코팅된 자성 나노입자에 CLEA 방법과 공유결합법으로 각각 고정화한 Candida rugosa lipase는 자유효소에 비해 초기반응속도 뿐만 아니라 최종 활성도 높았고, 5 회 재사용한 후 측정한 활성이 최초 활성 대비 73 % 이상의 활성을 유지하였다.
Candida cylindracea lipase was immobilized by adsorption on acid washed glass beads. It was observed that protein loading of the support depends on the size of the particle, with smaller particle containing higher amount of protein per unit weight. Initial reaction rate linearly varied up to enzyme concentration of 17.25 U/mL. Amount of free fatty acids produced was linearly proportional up to the enzyme loading of 1650 $\mu$g/g of bead. Achievement of chemical equilibrium took longer time in the case of less protein loading. Degree of hydrolysis was found to decrease in second and third consecutive batch operations on repeated use of immobilized lipase.
Kim, Dong-Joon;Shin, Dong-Hoon;Hur, Byung-Ki;Kim, Eun-Ki
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제10권6호
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pp.836-839
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2000
Beef tallow, which is an industrial lipid substrate, was hydrolyzed by lipase immobilized on a high-density polyethylene (HDPE) powder. Ethanol pre-washing process affected the immobilization efficiency. Half-life of storage of the HDPE at $4^{\circ}C$ was 150 days. And after 10 times of repeated use, more than 50% of initial activity remained. An apparent Michaelis constant ($K_m$) and maximum velocity ($V_{max}$) were 2.7M, and 1.4 mmol/min/l for immobilized lipase, and 0.5 M, and 1.9 mmol/min/l for soluble lipase, respectively.
Proteus vulgaris K80 lipase was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) cells and immobilized on amine-terminated magnetic microparticles (Mag-MPs). The immobilization yield and activity retention were 84.15% and 7.87%, respectively. A homology model of lipase K80 was constructed using P. mirabilis lipase as the template. Many lysine residues were located on the protein surface, remote from active sites. The biochemical characteristics of immobilized lipase K80 were compared with the soluble free form of lipase K80. The optimum temperature of K80-Mag-MPs was $60^{\circ}C$, which was $20^{\circ}C$ higher than that of the soluble form. K80-Mag-MPs also tended to be more stable than the soluble form at elevated temperatures and a broad range of pH. K80-Mag-MP maintained its stable form at up to $40^{\circ}C$ and in a pH range of 5.0-10.0, whereas soluble K80 maintained its activity up to $35^{\circ}C$ and pH 6.0-10.0. K80-Mag-MPs had broader substrate specificity compared with that of soluble K80. K80-Mag-MPs showed about 80% residual relative activity after five recovery trials. These results indicate the potential benefit of K80-Mag-MPs as a biocatalyst in various industries.
Biodiesel is methyl and ethyl esters of long-chain fatty acids produced from vegetable oils or animal fats. Lipase enzymes have occasionally been used for the production of this biofuel. Recently, biodiesel production using immobilized lipase has received increased attention. Through enhanced stability and reusability, immobilized lipase can contribute to the reduction of the costs inherent to biodiesel production. In this study, methanol-tolerant lipase M37 from Photobacterium lipolyticum was immobilized using the cross-linked enzyme aggregate (CLEA) method. Lipase M37 has a high lysine content (9.7%) in its protein sequence. Most lysine residues are located evenly over the surface of the protein, except for the lid structure region, which makes the CLEA preparation yield quite high (~93%). CLEA M37 evidences an optimal temperature of $30^{\circ}C$, and an optimal pH of 9-10. It was stable up to $50^{\circ}C$ and in a pH range of 4.0-11.0. Both soluble M37 and CLEA M37 were stable in the presence of high concentrations of methanol, ethanol, 1-propanol, and n-butanol. That is, their activities were maintained at solvent concentrations above 10% (v/v). CLEA M37 could produce biodiesel from olive oil and alcohols such as methanol and ethanol. Additionally, CLEA M37 generated biodiesel via both 2-step methanol feeding procedures. Considering its physical stability and reusability, CLEA M37 may potentially be used as a catalyst in organic synthesis, including the biodiesel production reaction.
This review focuses on the use of immobilized lipase technology for the hydrolysis of oils. The importance of lipase catalyzed fat splitting process, the various immobilization procedures, kinetics, deactivation kinetics, New immobilized lipases for chiral resolution, reactor configurations, and process considerations are all reviewed and discussed.
본 연구는 polyethyleneimine(PEI)을 이용하여 음이온계 레진에 비 고정화 효소인 lipase AH(Burkholderia cepacia)를 고정화한 후 효소적 interesterification을 통해 고정화 효소의 반응 특성을 확인하고자 하였다. 효소적 interesterification에 canola oil, palmitic ethyl ester와 stearic ethyl ester를 기질로 사용하였으며 합성물의 TAG 조성 분석을 통해 특성 연구를 진행하였다. 또한 두 가지 고정화방법(multi layer, mono layer)으로 고정화를 진행하였으며 사용된 lipase solution의 농도와 pH를 달리하여 실시하였다. 먼저 효소와 support 간의 친화력을 확인하기 위하여 단백질 함량을 측정하였다. 그 결과 고정화에 사용된 lipase solution의 농도가 8 mg/mL일 때 친화력이 좋았으며 MUIM의 경우 pH 7.5에서, MOIM의 경우 pH 8.0에서 고정화 효율이 가장 좋았다. 또한 고정화 효소의 활성을 확인하기 위하여 interesterification을 진행하였고 TAG와 sn-2 position 분석을 통하여 활성을 비교하였다. 이러한 결과를 참고하여 가장 친화력이 좋았던 조건에서 고정화를 진행하였다. 그 결과 MUIM의 경우 total saturated fatty acid(${\Sigma}SFA$)의 함량이 16.79 area%였으며 MOIM의 경우는 ${\Sigma}SFA$의 함량이 26.17 area%로 나타났다. 반면에 sn-2 position 분석결과 MUIM과 MOIM 모두 palmitic acid와 stearic acid의 함량이 증가한 경향을 나타내었는데, 이는 기존의 sn-1, 3 특이성을 가지는 lipase AH가 고정화를 통해 무작위 특이성으로 변화한 것으로 생각되었다. 또한 RP-HPLC를 이용하여 TAG의 조성을 확인한 결과, 기질은 canola oil이 주로 OOO와 LOO로 조성되었으나 고정화 효소의 interesterification 반응 후 합성물은 주로 POO/SLO, LPO/LOP와 SOO, SOS 등으로 이루어진 것으로 확인되었다. 위와 같은 결과를 바탕으로 최종 생산된 MUIM과 MOIM을 이용하여 interesterification 반응을 온도, 시간을 달리하여 진행하였다. 전체적으로 MOIM의 활성이 가장 높았으며 lipase AH, MOIM과 MUIM 모두 반응시간이 증가할수록 ${\Sigma}SFA$의 함량은 증가하였으나 12시간 이후로는 시간대비 효율은 크게 증가하지 않았다. 또한 시간이 증가함에 따라 sn-2 position의 ${\Sigma}SFA$ 함량이 높아졌다. 한편 반응온도가 높을수록 ${\Sigma}SFA$의 함량도 증가하였는데, 이는 상온인 $25^{\circ}C$보다 높은 melting point를 가지는 stearic ethyl ester와 palmitic ethyl ester가 semi solid 형태로 존재하여 활성이 저해된 것으로 생각된다. 또한 lipase AH는 재사용이 불가능하였지만 고정화 효소인 MUIM과 MOIM은 5번을 재사용하여도 그 효소의 활성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 음이온계 레진에 PEI를 이용하여 lipase AH를 고정화하였을 경우 비 고정화 효소인 lipase AH보다 MUIM과 MOIM의 활성이 더 높아 산업적으로 이용 가능할 것으로 생각된다.
Lipase from Candida rugosa was immobilized on $MgO{\cdot}SiO_2$ hybrid grafted with amine, thiol, cyano, phenyl, epoxy and carbonyl groups. The products were analyzed using Fourier transform infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance, low-temperature $N_2$ sorption and elemental analysis. Additionally, the degree of coverage of the oxide material surface with different functional groups and the number of surface functional groups were estimated. The Bradford method was used to determine the quantity of immobilized enzyme. The largest quantity of enzyme (25-28 mg/g) was immobilized on the hybrid functionalized with amine and carbonyl groups. On the basis of hydrolysis reaction of p-nitrophenyl palmitate to p-nitrophenol, it was determined how the catalytic activity of the obtained biocatalysts is affected by pH, temperature, storage time, and repeated reaction cycles. The best results for catalytic activity were obtained for the lipase immobilized on $MgO{\cdot}SiO_2$ hybrids with amine and carbonyl groups. The biocatalytic system demonstrated activity above 40% in the pH range 4-10 and in the temperature range $30-70^{\circ}C$. Lipase immobilized on the $MgO{\cdot}SiO_2$ systems with amine and epoxy groups retains, respectively, around 80% and 60% of its initial activity after 30 days of storage, and approximately 60-70% after 10 reaction cycles.
In our previous study, a surfactant-coated Candida rugosa lipase immobilized in microemulsion-based organogels was exploited for the synthesis of ethyl isovalerate. In the present study, we are focusing on the effective reuse of lipase immobilized in microemulsion-based organogels (MBGs) in terms of retainment of the catalytic activity. As water is one of the co-products in esterification reactions, the removal of water becomes a priority to allow the reaction to work in the forward direction and to prevent back hydrolysis. Taking this fact into consideration, the lipase-containing microemulsion-based organogels were given pretreatment and/or several intermittent treatments with dry reverse micellar solution of AOT in organic solvent during repeated cycles of ester synthesis. The pretreated MBGs with dry reverse micellar solution exhibited lower water content and higher initial rates of esterification in comparison with untreated freshly prepared MBGs. The esterification efficiency of untreated MBGs started decreasing after 5 cycles of reuse and was almost completely lost by the end of the $8^{th}$ cycle. In contrast, pretreated MBGs exhibited a gradual decrease in esterification efficiency after 5 cycles and retained about 80% of the initial activity at the end of the $8^{th}$ cycle. The intermittent treatment of MBGs after every 3 cycles resulted in enhanced reusability of immobilized lipase for up to 9 cycles without significant loss in esterification activity, after which it resulted in a slow decrease in activity with about 27% lower activity at the end of the $12^{th}$ cycle. Furthermore, the treatment conditions such as concentration of AOT in liquid dessicant and time of treatment were optimized with respect to our system. The granulated MBGs proved to be better in terms of initial esterification rates (1.2-fold) as compared with the pelleted MBGs.
Candida rugosa와 Rhizopus arrhizus 리파제를 photocrosslinkable resin prepolymer에 고정화시켜서 이소옥탄을 유기용매로 사용한 이상계를 이용해서 유지분해 및 에스테르교환 반응을 보고자했다. Dioctylsulfosuccinate가 가장 좋은 surfactant였다. 소수성 젤인 ENTP-3000에 고정된 리파제가 좋은 활성을 나타냈고 친수성 젤인 ENT-4000에 고정된 리파제가 유기용매에 대해 안정했다. 고정화 matrix의 소수성이 증가될수록Vm(app)는 증가되었으나 Km(app)는 거의 일정했다. 리파제의 최적 pH는 소수성 젤인 ENTP-3000에 고정된 경우 C. rugosa와 R. arrhizus 리파제에 대해서 각각 6.0과 6.5였으나, 친수성 젤에 고정된 리파제는 짧은 시간 반응에는 pH에 크게 영향을 받지 않았으나 긴 시간 동안 반응시킬 때는 역시 pH6.0과 6.5에서 각각 C. rugosa와 R. arrhizus 리파제가 높은 양의 지방산을 분해시켰다. 리파제를 entrapment 시키면 열안정성이 증가됨을 알 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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