본 연구에서는 효소적 생물전환을 이용하여 오가피의 생리활성 물질인 eleutheroside B와 E의 추출 함량을 증대시키는 방안을 모색하였다. 효율적인 열수추출 공정을 위해 줄기분말에 질량대비 가수를 한 결과 14배 가수를 선정하였다. 이후 줄기 분말에 다양한 가수분해 효소를 이용하여 처리한 결과 유효성분의 용출량을 증가시키는 효소로 Novozyme 33095, Viscozyme L을 선정하였다. 효소처리 시간별로 유효성분의 용출량을 비교한 결과 eleutheroside B와 E의 용출량은 가시오가피 줄기에 Novozyme 33095로 3시간 처리하였을 경우 eleutheroside B의 용출량이 대조구 대비 약 13%가 증가하였고, eleutheroside E의 용출량은 대조구 대 비 약 26%로 가장 많이 증가하였다. 효소처리 후 토종오가피와 가시오가피의 줄기의 효과적인 열수추출 조건을 확인해 본 결과 토종오가피를 $121^{\circ}C$에서 15분 동안 추출하였을 때 eleutheroside B의 추출 함량은 기존 열수추출 공정대비 약 7%가 증가하였고, eleutheroside E의 추출 함량은 약 17%가 유의적으로 증가하였다. 가시오가피 줄기를 $121^{\circ}C$에서 15분 동안 추출하였을 때 eleutheroside B의 추출 함량은 기존 열수추출 공정대비 약 25%가 유의적으로 증가하였고, eleutheroside E의 추출 함량은 약 29%가 유의적으로 증가하였다.
탐라오가피를 기능성 식품소재로 활용하기 위하여 물과 주정의 비율을 달리하여 추출시간에 따른 유용성분의 경시적 변화를 검토하였다. 물 및 주정농도를 각각 $30{\sim}95%$로 조절한 다음 0.5 cm 이하로 세절한 뿌리를 300 g/7.5 L의 비율로 첨가하여 9시간 동안 $100^{\circ}C$의 항온수조에서 환류냉각으로 추출하였을 때, 추출을 시작한 후 3시간까지 pH가 낮아졌으며, pH $4.0{\sim}6.5$ 범위였다. 색도 a값은 추출용매에 따라 차이가 있었으나, 추출 $2{\sim}3$시간까지에 변화가 컸다. 색도 b 값은 주정농도가 낮을수록, 추출시간이 경과함에 따라 증가하는 경향이었다. 가용성고형물은 추출을 시작한 직후부터 $2{\sim}3$시간 안에 급증하였으며, 물 및 주정농도가 낮을수록 많이 추출되었다. 주정농도 $30{\sim}70%$인 경우 뿌리에서 $0.84{\sim}1.34%(w/v)$로 줄기보다 뿌리에서 가용성고형물 함량이 높았다. 추출액에 함유된 주요 유리당은 sucrose이었다. Eleutherosides 성분은 주정농도가 높을수록 추출을 시작한 직후부터 3시간까지 급속히 증가하였으며, 주정 원액보다 물 및 주정을 혼합하여 추출하였을 때가 함량이 높았다. 뿌리에서 acanthoic acid 추출은 추출시간보다 주정 농도에 의한 영향이 컸고, 물로 추출할 경우에는 미량이 검출되었다. 또한, 주정농도 $50{\sim}70%$에서 2시간까지 acanthoic acid 추출이 빨리 일어났으며, 주정농도 70%에서가 30%일 때보다 3배 높게 이루어졌다. 추출 잔사에 남아있는 acanthoic acid 함량은 추출용매에 많은 영향을 받았다. 주정농도 70%에서는 원료의 약 95%, 주정농도 50%인 경우는 약 90%, 주정농도 30%인 경우는 약 35%가 추출되었다. Eleutherosides성분은 물 및 물에 주정을 혼합하여 $3{\sim}5$시간 추출하였을 때, 원료의 약 95%추출되었다. 따라서 탐라오가피의 기능성분을 많게 하고 추출효율을 높게 하는 알맞은 추출방법은 주정농도 $40{\sim}70%$로 $3{\sim}5$시간 동안 환류 추출하는 것이었다.
탐라오가피를 이용하여 건강기능식품 개발 시 원료의 표준화를 위한 eleutheroside B, E 및 ${\beta}$-glucan의 함량 및 분석법 검증을 실시하였다. 분석법 검증결과, HPLC를 이용한 분석방법에서 표준용액의 피크유지시간과 탐라오가피 뿌리 및 줄기 추출물의 피크유지시간이 일치하였으며 동일한 spectrum을 나타내는 것으로 특이성을 확인하였다. Eleutheroside B와 E의 검량선은 각각 0.9997, 0.9999로 1에 가까운 높은 직선성을 보여주어 분석에 적합함을 알 수 있었다. Eleutheroside B와 E의 검출한계는 각각 $0.050{\mu}g/mL$, $0.025{\mu}g/mL$이었고 정량한계는 $0.250{\mu}g/mL$로 eleutheroside B와 E가 동일한 값으로 설정되었다. Eleutheroside B의 함량은 탐라오가피 뿌리 및 줄기에서 각각 $525.7{\pm}16.8$, $525.1{\pm}21.1{\mu}g/g$으로 큰 차이가 없었으며 eleutheroside E의 함량은 뿌리 및 줄기에서 각각 $1,315.3{\pm}22.7$, $1,037.5{\pm}22.2{\mu}g/g$으로 뿌리에 더 많은 eleutheroside E가 함유되어 있었다. 정밀도(RSD) 측정 결과, eleutheroside B와 E는 일간 정밀도에서 각각 1.4~5.0, 1.1~2.5%의 정밀도를 보여주었으며 일내 정밀도에서는 각각 2.8~2.9, 0.4~1.1%로 일간 정밀도보다 높은 정밀성을 나타내었다. 또한 eleutheroside B는 100.66~110.04%, eleutheroside E는 94.26~111.62% 범위의 회수율을 보여주어 실험방법에 대한 정확성을 검증하였다. ${\beta}$-Glucan 분석법 검증 결과, 100.03%의 회수율을 보였으며 분석오차는 2.33%로 높은 정확도를 보여주었고, 일간(inter-day) 정밀도는 1.32~5.67%이었으며 일내(intra-day) 정밀도는 8.01~11.76%의 정밀성을 나타내었다. 탐라오가피 줄기, 잎 및 열매의 ${\beta}$-glucan 함량은 각각 $5.32{\pm}0.38$, $4.34{\pm}0.32$, $3.71{\pm}0.22%$(w/w)로 줄기에 가장 많은 ${\beta}$-glucan이 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과, 지표성분인 eleutheroside B와 E의 HPLC를 이용한 동시분석 방법과 ${\beta}$-glucan 분석방법이 적합한 분석방법임이 검증되었다.
오가피의 주요 성분으로 알려져 있는 eleutheroside B와 E 그리고 식물의 세포벽을 구성하는 ${\beta}$-glucan 함량을 강원도(A. senticosus), 충남(A. senticosus), 제주도(A. koreanum) 산지별 오가피의 뿌리, 줄기, 잎, 열매 부위별로 각각 분석한 결과, 충남 오가피는 eleutheroside B가 검출되지 않는 것에 반해 특이적으로 높은 eleutheroside E를 함유하고 있었으며, 제주도 산지 오가피는 뿌리, 줄기, 잎, 열매모든 부위에서 eleutheroside B와 E가 함께 검출되는 것으로 확인되었다. 서로 다른 산지에서 재배되었지만 지역과 품종에 상관없이 줄기 부위에 가장 많은 eleutheroside B와 E가 함유되어 있었으며, ${\beta}$-glucan 또한 강원도(7.46%), 충남(3.41%), 제주도(5.05%) 산지 오가피 모두 줄기 부위에 가장 많았다. 오가피는 같은 품종이더라도 재배지역에 따라 eleutheroside B와 E 그리고 ${\beta}$-glucan 함량에 차이를 보여주었고 산지와 품종에 상관없이 줄기 부위에 가장 많이 함유되어 있었다. 따라서 본 연구결과를 기초로 오가피 소재 제품을 만들기 위해서는 제품의 목적에 따라 산지 및 부위의 선택이 필요할 것으로 사료되며, 산지에 따른 유효성분 차이에 있어서 탐라오가피는 제주도 특산식물로 오가피를 이용한 제품개발 시 지표성분을 표준화하는데 있어서 용이할 것으로 판단된다.
생물반응기를 이용한 섬오갈피 부정근 배양시 첨가되는 생장조절제의 종류와 농도에 따른 부정근의 생장과 이차대사산물 생산과의 관계를 조사하였다. IBA 농도별 부정근 생장은 IBA $2.0\;\cal{mg/L}$에서 6.7 g DW/L로 가장 높았으나, eleutheroside E 함량은 IBA 농도에 따라 차이가 없었다 TDZ 농도에 따른 부정근 생장은 농도가 증가함에 따라 생장도 증가하여 eleutheroside E 함량은 IBA $3.0\;\cal{mg/L}$에 TDZ $0.1\;\cal{mg/L}$ 처리구에서 $3,327\;{\mu}g/g$ DW로 가장 생산량이 많았다. 이와 달리 eleutheroside B ($153\;{\mu}g/g$ DW)과 chlorogenic acid ($7.7\;\cal{mg/g}$ DW)는 IBA $5.0\;\cal{mg/L}$에 TDZ $0.1\;\cal{mg/L}$ 처리구에서 함량이 가장 높았다. Zeatin은 부정근 생육과 eleutheroside E 함량에는 크게 영향을 미치지 않으나 eleuthe-roside B와 chlorogenic acid 생산을 크게 억제하였다.
생물반응기를 이용하여 섬오갈피 부정근 증식시 부정근의 생장과 유용 이차대사산물인 eleutheroside 류 생산에 미치는 ${NO_3}^-$와 ${NH_4}^+$의 영향 및 배양기간에 따른 배지성분의 변화량을 분석하였다. 부정근 증식은 질소농도가 50 mM ${NO_3}^-$와 10 mM ${NH_4}^+$ 농도비율로 첨가된 처리구에서 최대(30.8 g FW/L)에 이르러 60 mM ${NH_4}^+$ 첨가에 비해서는 3.6배 증식되었다. 또한 ${NH_4}^+$의 첨가농도비율이 높아질수록 부정근의 증식은 감소하였다. 그러나 eleutheroside B는 총 질소량이 30 mM 처리에서 $57.3{\mu}g/g$ DW, E는 60 mM 처리에서 $188.4{\mu}g/g$ DW의 함량으로 생산량이 가장 많았다. 반면에 eleutheroside $E_1$은 총 질소량이 15 mM 처리에서 $47.3{\mu}g/g$ DW로 생산량이 가장 많았다. 부정근 최대생장은 초기 접종량 대비 배양 9주만에 6.8배가 증식되었고, 배양기간별 배지 성분의 변화에서 ${NH_4}^+$, $K^+$, ${NO_3}^-$와 ${PO_4}^-$는 배양기간이 경과할수록 함유량이 감소하였다. 이러한 결과로 보아 부정근의 생장과 유용이차대사산물의 함량을 높이기 위하여 다양한 처리의 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
생물반응기를 이용하여 가시오갈피 부정근 증식시 부정근의 생장과 유용 이차대사산물인 eleuthroside 류 생산에 미치는 $NO_3{^-}$와 $NH_4{^+}$의 영향 및 배양기간에 따른 배지성분의 변화량을 분석하였다. 부정근 증식은 질소농도가 50 mM $NO_3{^-}$와 10 mM $NH_4{^+}$ 농도비율로 참가된 처리구에서 최대(24.4g FW/L)에 이르러 60 mM $NH_4{^+}$ 첨가에 비해서는 3.4배 증식되었다. 또한 $NH_4{^+}$의 첨가농도비율이 높아질수록 부정근의 증식은 감소하였다. Eleutheroside B와 E1은 총 질소량이 30 mM 처리에서 각각 $249{\mu}g/g$와 $43{\mu}g/g$을 생산하여 가장 우수하였으나, eleutheroside E는 총 질소농도가 높아질수록 생산량도 높아져 120 mM에서 $788{\mu}g/g$로 가장 우수하였다. 부정근 생장은 초기 접종량 대비 배양 9주만에 6.2배가 증식되었고, 배양기간별 배지 성분의 변화에서는 산도는 4.81-6.35로 변화가 비교적 심했고, $NH_4{^+}$와 $K^+$는 배양기간이 경과할수록 함유량이 낮았다. 이러한 결과로 보아 부정근의 생장과 유용이차대사산물의 함량을 높이기 위하여 다양한 처리의 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
생물반응기를 이용한 가시오갈피 부정근 배양시에 jasmonic acid를 농도별 (0, 0.01, 0.05, 0.1, 03, 0.5 mg/L)로 처리하여 부정근의 생장과 eleutheroside류 생산과의 관계를 조사하였다. Jasmonic acid 처리농도별 부정근의 생장은 무처리구에서 4.6 g Dry weight (DW)/L로 가장 높았으며 jasmonic acid 농도가 증가할수록 부정근 생장은 감소하였다. 그러나 eleutheroside B와 E의 함량은 jasmonic acid 농도가 높을수록 증가하여 0.5 mg/L 처리구에서 각각 $476.3{\mu}g/g\;DW$, $676.0{\mu}g/g\;DW$로 생산량이 가장 많았다. 반면에 eleutheroside $E_1$은 0.01 mg/L 처리구에서 $46.1{\mu}g/g\;DW$로 생산량이 가장 많았다. 배지 1L당 eleutheroside류의 총생산량은 0.01 mg/L 처리구에서 $2468.6{\mu}g/L$를 생산하여 가장 우수하였다. 0.1 mg/L의 jasmonic acid 처리 후 10일간 eleutheroside류의 함량을 조사한 결과 eleutheroside B는 jasmonic acid처리 후 6일째, eleutheroside E는 처리 후 8일째, eleutheroside $E_1$은 처리 후 4일째 각각 가장 많은 생산량을 보여 주었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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