• Radiation Oncology Journal
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• 제17권1호
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• pp.70-77
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• 1999

목적 : 연구자들은 배양 배지의 산성환경이 SCK 선암세포에서 apoptosis를 유도하는 것과 산성환경이 SCK 선암 세포주에서 방사선에 의해 유도되는 apoptosis를 억제시킨다고 관찰하고 apoptosis 관련 유전자들인 p53, p21/WAF/CIP, Bcl-2 및 Bax 들의 발현과 배양 배지 pH 환경과의 연관성을 관찰하였다. 대상 및 방법 : SCK 선암 세포주를 체외 방사선 조사기를 이용하여 방사선 120Gy 조사 후 규정된 시간에 DNA fragmentation을 전기 영동으로 관찰하였다. 실험 조작으로 apoptosis가 유발된 세포군을 정량적으로 분석하고 세포주기 분석을 위하여 FACScan을 이용하였다. Apoptosis 관련 유전자들인 p53, P21/WAF/CIP, Bcl-2 및 Bax 들의 발현은 western blot으로 관찰하였다. 결과 : SCK 선암 세포주에서 방사선에 의해 유도되는 apoptosis는 산성환경(pH 6.6)에서는 apoptosis의 유발이 억제 된다는 사실을 관찰할 수 있었다. 세포주기 분석에서는 방사선조사 후 apoptosis가 뚜렷히 관찰된 pH 7.5 배양 배지 조건에 비하여 pH 6.6 배양 배지 조건에서 현저한 G2/M arrest가 관찰 되었다. apoptosis 관련 유전단백 분석에서는 Bcl-2 유전단백은 두 군 공히 발현의 차이를 관찰할 수 없었고, p53 및 p21은 pH 7.5 배양 배지 환경에서 뚜렷한 발현의 증가를 관찰하였고, p21은 pH 6.6 배양 배지 환경에서는 발현을 관찰할 수 없었다. Bax는 pH 7.5 배양 배지 환경에서 pH 6.6 환경에 비해 경미한 발현의 증가 및 지속성을 관찰하였다. 결론 . 저자들은 SCK 선암 세포주를 대상으로 방사선조사 후 상이한 pH 7.5 와 6.6의 배양 배지 조건에 따른 apoptosis의 관찰에 영향을 주는 유전자 발현에 관한 연구에서 Bcl-2 family의 발현에 비해 세포주기 관련 유전단백들인 p53 발현과 이에 따른 p21의 발현차이가 확연한 p53-dependent apoptotic pathway를 확인하였다. 방사선 조사 후 pH 6.6의 배양 배지 조건에서의 apoptosis 현상을 관찰할 수 없었던 이유는 pH 6.6의 경우 50-60$\%$의 세포가 G2/M arrest에서 세포주기를 순환하지 못함을 확인하였기에 G2/M arrest의 해지와 더불어 순환되는 세포주기의 결과에 따른 post-mitotic apoptosis 현상의 장애로 추론하였다.

• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제35권3호
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• pp.165-175
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• 2010

Valproic acid(VPA)는 아주 잘 알려진 항경련제로서, 30년 동안 간질치료제로서 사용되어져 왔다. VPA는 1997년에 최초로 원시 신경외배엽성 암세포의 증식 억제와 분화를 유도하는 항암제의 효능이 밝혀졌다. 그리고 VPA의 항암효과는 히스톤탈 아세틸화효소억제제의 기전에 기인한다고 규명되었다. 담즙산과 합성담즙산유도체가 여러 종류의 암세포에 세포자멸사(apoptosis)를 유도하며, 항암효과가 있다고 알려져 있다. 또한 합성 chenodeoxycholic acid(CDCA) 유도체가 여러 가지 암세포에 유도한 세포자멸사 연구들이 보고되어져 왔다. 본 연구는 히스톤탈아세틸화효소억제제인 VPA와 합성 CDCA 유도체인 HS-1200의 병용처리가 사람골육종세포에 효과적인 상승 세포자멸사 효과가 있는지를 알기 위해서 수행되었다. VPA과 HS-1200의 병용처리가 단독처리에 비해서 효과적인 세포생존율 감소가 있는지 확인하기 위해서 trypan-blue법을 시행하였고, 세포자멸사의 유도와 증가를 확인하기 위해서 Hoechst 염색법, flow cytometry(DNA hypoploidy와 MMP 측정), Western bot 분석법 그리고, 면역형광염색법을 수행하였다. 병용처리 된 사람골육종세포는 단독처리 된 사람골육종세포에서 거의 관찰할 수 없었던 많은 핵 응축, DNA 조각남, 사립체막 전위와 DNA 양의 감소, cytochrome c의 세포질로의 유리, AIF의 핵으로의 이동, caspase-7, caspase-3 그리고 PARP의 파괴와 같은 세포자멸사 증거를 보였다. 48시간 동안 1 mM의 VPA와 $25\;{\mu}M$ HS-1200을 각기 단독처리 한 결과에서는 세포자멸사를 유도 못했으나, 병용처리한 결과에는 아주 탁월한 세포자멸사의 유도를 보였다. 이러한 병용처리 결과는 사람골육종의 새로운 치료적 전략으로 응용될 수 있다고 생각한다.

• Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons
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• 제29권5호
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• pp.272-281
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• 2003

본 연구에서는 두경부암 HN-4 세포에서 cancer chemopreventive agent인 curcumin과 resveratrol를 처리하여 HN-4 세포의 생육 억제의 원인이 apoptotic cell death에 의하여 일어나며 세포 주기 조절 단백질의 발현 및 암 전이에 관련된 MMP 활성 저해 기전에 대하여 이해하고자 하였다. HN-4 세포에 다양한 농도(10-100 ${\mu}M$) curcumin을 처리하여 세포주기 조절 단백질의 발현을 측정한 결과 cdk1과 cdk4 단백질이 농도 의존적으로 발현이 감소하였으며, resveratrol 처리에서는 cyclin A 단백질의 특이적인 감소 현상을 확인하였다. Curcumin에 의한 apoptosis 유도 기전을 조사한 결과 anti-apoptotic 기능이 있는 Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질 발현 감소 현상은 없었으나, caspase 저해 IAP family 단백질중 cIAP1과 survivin 단백질 발현 현상이 처리 농도 의존적으로 감소하였다. Resveratrol을 처리한 경우 Bcl-2 및 survivin 단백질 발현 감소현상을 확인하였다. Curcumin과 resveratrol에 의한 apoptosis 과정은 caspase-3 의존적인 apoptosis 유도 기전을 보였다. Curcumin에 의한 apoptosis 과정은 항산화제인 NAC 처리에 의해서 저해되었다. Curcumin과 NAC 동시 처리는 cytochrome c 유리, caspase-3 활성화 및 Bax 단백질 분절 현상을 억제하였다. 그러나 resveratrol에 의한 apoptosis 과정은 NAC 처리에 의하여 억제되지 않았다. Curcumin과 resveratrol에 의한 암 전이 관련 단백질인 MMP2와 9의 활성 저해효과도 확인하였다. 결론적으로, curcumin에 의한 항암효과는 세포주기 조절 및 apoptosis 유도 및 전이 관련 단백질의 활성 억제를 통하여 야기되는 것으로 생각되어 진다.

• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제38권3호
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• pp.221-233
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• 2013

담즙산은 지방의 흡수와 콜레스테롤의 항상성을 조절하는 유전자의 전사에 관여하는 필수 콜레스테롤의 생성물이다. 담즙산 합성유도체인 HS-1200이 여러 가지 암세포에서 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다는 것이 알려져 있다. 본 연구는 사람혀 편평세포암종세포(SCC25 cells)에서 담즙산 합성유도체인 HS-1200과 대표적인 항암제인 cisplatin의 병용처리 후 세포자멸사 증가효과가 있는지 알아보기 위해 수행하였다. HS-1200과 cisplatin의 병용처리가 단독처리에 비해서 효과적인 세포생존율 감소가 있는지 확인하기 위해서 MTT법을 시행하였고, 세포자멸사의 유도와 증가를 알기 위해서는 DNA 전기영동법, Hoechst 염색법, DNA hypoploidy법 을 사용하였다. 그리고 세포자멸사에 관계하는 단백질의 발현 변화와 세포내에서의 이동을 밝혀내기 위해서 Western blot 분석과 면역형광 염색법을 수행하였다. 더 나아가서 proteasome 활성도와 사립체막 전위 변화를 측정하였다. 본 연구에서는 HS-1200과 cisplatin을 병용처리한 SCC25 세포에서 핵의 농축, DNA분절, MMP와 proteasome 활성도의 감소, Bax의 증가와 Bcl-2의 감소, DNA양의 감소, cytochrome c의 세포질로의 유리, AIF와 DFF40(CAD)의 핵으로의 이동, caspase-9, caspase-7, caspase-3, PARP 그리고 DFF45(ICAD)의 활성화와 같은 다양한 세포자멸사 증거를 보였다. 반면에 상기 물질들에 단독처리 된 SCC25 세포에서는 세포자멸사 현상이 거의 없었다. 24시간 동안 $25{\mu}M$의 HS-1200, $4{\mu}g/ml$의 cisplatin 을 각기 단독처리 한 결과에서는 세포자멸사를 거의 유도하지 못했으나, 병용처리한 결과에는 아주 탁월하고 명확한 세포자멸사의 유도를 보였다. 그러므로 본 실험결과는 HS-1200과 cisplatin 의 병용요법이 사람구강편평세포암종 환자를 위해 새로운 치료전략으로서의 가능성을 보여준다고 생각한다.

• Molecules and Cells
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• 제37권2호
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• pp.178-186
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• 2014

Differential transcription of the clusterin (CLU) gene yields two CLU isoforms, a nuclear form (nCLU) and a secretory form (sCLU), which play crucial roles in prostate tumorigenesis. Pro-apoptotic nCLU and anti-apoptotic sCLU have opposite effects and are differentially expressed in normal and cancer cells; however, their regulatory mechanisms at the transcriptional level are not yet known. Here, we examined the transcriptional regulation of nCLU in response to hypoxia. We identified three putative hypoxia response elements (HREs) in the human CLU promoter between positions -806 and +51 bp. Using a luciferase reporter, electrophoretic gel mobility shift, and chromatin immunoprecipitation assays, we further showed that hypoxia-inducible factor-$1{\alpha}$ (HIF-$1{\alpha}$) bound directly to these sites and activated transcription. Exposure to the hypoxia-mimetic compound $CoCl_2$, incubation under 1% $O_2$ conditions, or overexpression of HIF-$1{\alpha}$ enhanced nCLU expression and induced apoptosis in human prostate cancer PC3M cells. However, LNCaP prostate cancer cells were resistant to hypoxia-induced cell death. Methylation-specific PCR analysis revealed that the CLU promoter in PC3M cells was not methylated; in contrast, the CLU promoter in LNCap cells was methylated. Co-treatment of LNCaP cells with $CoCl_2$ and a demethylating agent promoted apoptotic cell death through the induction of nCLU. We conclude that nCLU expression is regulated by direct binding of HIF-$1{\alpha}$ to HRE sites and is epigenetically controlled by methylation of its promoter region.

• 생명과학회지
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• 제19권11호
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• pp.1581-1590
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• 2009

H. fusiformis는 갈조식물, 모자반과의 해조류로서 우리나라의 서해안, 남해안, 및 제주도를 비롯해 중국, 일본 등 아시아 전역에 서식하는 천연자원식물이다. 최근 톳의 항산화 활성에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있으나 항암에 대한 연구 및 분자생물학적 기전연구가 많이 미흡한 편이다. 따라서 본 연구에서는 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 대상으로 톳 에탄올 추출물(EAHF)에 의한 증식억제에 대하여 조사한 결과, 두 세포주 모두에서 EAHF을 처리하지 않은 군과 비교하여 EAHF의 처리 농도가 증가할수록 암세포의 증식이 현저하게 억제되었고 심한 형태적 변화를 관찰할 수 있었다. 이러한 유방암 세포의 증식억제 및 형태변화는 MDAMB-231에서는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었고, EAHF에 의해 유발된 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 flow cytometry를 이용하여 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 측정하였다. MDA-MB-231세포의 경우는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하여 $400{\mu}g/ml$의 농도에서는 약 23% 정도가 나타났지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis 유발보다는 G1 arrest 효과가 높게 나타났다. 또한 염색질 응축과 연관된 apoptotic body 형성과 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사하였다. MDAMB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰 할 수 있었지만 MCF-7세포에서는 DNA laddering이 거의 관찰되지 않았다. 또한 apoptosis 유발에 관여하는 여러 유전자들의 발현에 EAHF이 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 모두에서 death receptor에 속하는 여러 유전자의 발현에는 아무런 변화가 나타나지 않았으나, MDA-MB-231 세포에서 pro-apoptotic Bax의 발현 증가와 caspase-9 및 -3의 활성화, caspase-3의 기질 단백질들의 분해 등이 관찰되었다.

• 생명과학회지
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• 제23권3호
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• pp.389-398
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• 2013

Platycodin D는 도라지(Platycodon grandiflorum)의 뿌리인 길경(Platycodi Radix)에 함유된 은 triterpene saponin의 일종으로 다양한 약리효능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 다양한 암세포 중 platycodin D의 항암활성 감수성이 가장 높았던 인체 혈구암 U937 세포를 대상으로 platycodin D 처리에 따른 apoptosis 유발기전에 대하여 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 U937 세포에서 platycodin D 처리에 의한 증식억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었다. 이러한 platycodin D에 의한 apoptosis 유발은 pro-apoptotic Bax의 발현 증가와 연관된 미토콘드리아 막 전위의 소실 및 caspase-3의 활성화와 기질단백질들의 분해에 의한 것임을 알 수 있었으며, IAP family 인자들의 발현 감소가 caspase의 활성 증가에도 영향을 미친 것으로 추정된다. 또한 z-DEVD-fmk 선처리에 의하여 platycodin D에 의하여 유발된 apoptosis가 유의적으로 억제되었기에, platycodin D 처리에 의하여 유발되는 apoptosis는 미토콘드리아 경로에 의하여 조절되며, caspase-3의 활성화가 핵심적인 역할을 한 것으로 생각된다.

• Journal of Oral Medicine and Pain
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• 제36권3호
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• pp.147-160
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• 2011

Chios gum mastic (CGM)은 그리이스 키오스 섬에서만 자생하는 Pistiacia lentiscus L. var. Chia. 의 잎과 줄기로부터 추출되어진 식물성 수지이며, 과거 수세기 동안 지중해와 중동 지역 국가들에서 음식 첨가물과 위궤양, 십이지장궤양 등의 민간 치료약재로서 사용되어져 왔다. 정향나무에서 추출하는 페놀화합물인 eugenol은 zinc oxide eugenol의 구성성분으로 치과치료를 위해 많이 사용되고 있다. 본 연구는 사람혀편평세포암종세포(SCC25 cells)에서 천연물질인 CGM과 eugenol을 병용처리한 후 세포자멸사 효과가 있는지를 알아보기 위해 수행하였다. CGM과 eugenol의 병용처리가 단독처리에 비해서 효과적인 세포생존율 감소가 있는지 확인하기 위하여 MTT법을 시행하였고, 세포자멸사의 유도와 증가를 알기 위하여 Hoechst 염색법, TUNEL 염색법, DNA hypoploidy법을 사용하였다. 그리고 세포자멸사에 관계하는 단백질의 발현 변화와 세포내에서의 이동을 밝혀내기 위하여 Western blot 분석과 면역형광염색법을 수행하였다. 본 연구에서는 CGM과 eugenol이 병용처리된 SCC25 세포에서 핵의 농축, DNA분절, Bax의 증가와 Bcl-2의 감소, DNA양의 감소, cytochrome c의 세포질로의 유리, AIF와 DFF40 (CAD)의 핵으로의 이동, caspase-3, caspase-6, caspase-7, caspase-9, PARP, Lamin A/C 그리고 DFF45 (ICAD)의 활성화와 같은 다양한 세포자멸사 증거를 보였다. 반면에 CGM과 eugenol이 각각 단독 처리된 SCC25 세포에서는 세포자멸사 현상이 미미하였다. 24시간 동안 40 ${\mu}g$/ml의 CGM과 0.5 mM의 eugenol을 각기 단독처리 한 결과에서는 세포자멸사를 거의 유도하지 못했으나, 병용처리 한 결과에는 아주 탁월한 세포자멸사의 유도를 보였다. 그러므로 본 실험결과는 사람구강편평세포암종 환자들에게 CGM과 eugenol의 병용요법이 새로운 치료전략으로서의 가능성을 줄 수 있다고 생각한다.

• Radiation Oncology Journal
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• 제18권1호
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• pp.51-58
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• 2000

목적 : 방사선에 의해 유도되는 apoptosis에 내성을 가진 세포로 알려진 KS62 세포를 대상으로, PTK inhibitors인 herbimycin A와 genistein을 이용한 방사선에 의한 apoptosls의 내성 기전을 연구하고자 하였다. 대상 및 방법 : 6 MV 체외 X-선 방사선 치료기를 이용하여 200$\~$300 cGy/min의 선량률로 10 Gy의 X-선을 세포에 균일하게 조사하였다. Apoptosis의 관찰은 래arose gel electrophoresis를 이용하여 DNA frgmentation의 지표인 ladder를 관찰하였고, TUNEL 염색을 이용하여 정량 분석을 시행하였다. Western blot 방법으로 apoptosls 관련 유전 단백인 bel-2, bel-X$_L$ 및 bax들의 발현을 관찰하였다. 방사선 조사 및 약물 처치 후의 세포 주기 분석은 flow cytometry로 분석하였다. 결과 : Agarose gel electrophoresis 실험에서 방사선을 조사하지 않은 K562 세포와 방사선을 10 Gy 조사한 세포를 48시간에 걸쳐 12시간 간격으로 관찰하였을 때 DNA fragmentation를 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 genistein을 투여한 세포들에서도 동일한 현상을 관찰할 수 있었지만, 방사선 조사 후 herbimycin A를 투여한 세포들에서는 48 시간째 확연한 DNA fragmentation을 관찰할 수 있었다. 이를 TUNEL assay에서 정량적으로 확인하였다. 방사선만조사한 세포들과 방사선과 genistein 투여 후 48시간째 관찰한 세포들에서는 10$\%$, 미만의 apoptosis 양성 세포의 빈도를 관찰할 수 있었지만, 방사선 조사 후 herbimycin A를 투여한 세포들에서는 30$\~$35$\%$ 빈도로 apoptosis 양성 세포들이 관찰되었다. Western blot analysis에서 bcl-2의 경우 방사선을 조사하지 않았던 대조군에 비하여 전체적인 발현은 증가되었지만 방사선 및 약제간의 발현의 차이는 없었다. 그 외 bcl-X$_{L}$과 bax는 대조군에 비해 방사선 및 약제간의 발현의 차이를 관찰할 수 없었다. KS62 세포에 방사선을 10 Gy 조사하였을 때 나타나는 세포 주기의 변화는 시간이 경과함에 따라 전형적인 G2/M block의 소견을 보였다. 이러한 소견은 genistein을 투여했을 경우에는 특별한 변화를 보이지 않지만, herbimycin A를 투여했을 경우에는 12시간째부터 G2/M block이 소실되면서 세포가 세포 주기를 재 순환하는 양상을 보였고, 48시간째 관찰한 소견에서는 G2/M block이 거의 소실된 양상을 띠었다. 이러한 소견을 토대로 apoptosis 유도와의 상호 연관성을 유추할 수 있었다. 결론 : herbimycin A는 방사선에 의해 유도되는 apoptosis가 억제된 K562 세포에서 apoptosis를 유도할 수 있었다. 이러한 유도 기전에 apoptosis 관련 유전 단백들인 bcl-2, bcl-X$_{L}$ 및 bax와 관련된 영향은 관찰되지 않았다. 세포 주기의 분석에서 G2/M block의 해소와 apoptosis 유도와의 연관성을 유추할 때, 세포 주기 관련 인자들에 대한 연구가 방사선에 의한 apoptosis의 내성의 극복 및 방사선에 의한 세포의 감수성 조절 약제로서의 역할에 이바지할 것으로 생각한다.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제15권12호
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• pp.4773-4780
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• 2014

Background: To investigate the effects of small interference RNA (siRNA) targeting BCR/ABL mRNA on proliferation and apoptosis in the K562 human chronic myeloid leukemia (CML) cell line and to provide a theoretical rationale and experimental evidence for its potential clinical application for anti-CML treatment. Materials and Methods: The gene sequence for BCR/ABL mRNA was found from the GeneBank. The target gene site on the BCR/ABL mRNA were selected according to Max-Planck-Institute (MPI) and rational siRNA design rules, the secondary structure of the candidate targeted mRNA was predicted, the relevant thermodynamic parameters were analyzed, and the targeted gene sequences were compared with BLAST to eliminate any sequences with significant homology. Inhibition of proliferation was evaluated by MTT assay and colony-formation inhibiting test. Apoptosis was determined by flow cytometry (FCM) and the morphology of apoptotic cells was identified by Giemsa-Wright staining. Western blotting was used to analyze the expression of BCR/ABL fusion protein in K562 cells after siRNA treatment. Results: The mRNA local secondary structure calculated by RNA structure software, and the optimal design of specific siRNA were contributed by bioinformatics rules. Five sequences of BCR/ABL siRNAs were designed and synthesized in vitro. Three sequences, siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786, which showed the most effective inhibition of K562 cell growth, were identified among the five candidate siRNAs, with a cell proliferative inhibitory rate nearly 50% after exposure to 12.5nmol/L~50nmol/L siRNA1384 for 24,48 and 72 hours. The 50% inhibitory concentrations ($IC_{50}$) of siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786 for 24hours were 46.6 nmol/L, 59.3 nmol/L and 62.6 nmol/L, respectively, and 65.668 nmol/L, 76.6 nmol/L, 74.4 nmol/L for 72 hours. The colony-formation inhibiting test also indicated that, compared with control, cell growth of siRNA treated group was inhibited. FCM results showed that the rate of cell apoptosis increased 24 hours after transfecting siRNA. The results of annexinV/PI staining indicated that the rate of apoptosis imcreased (1.53%, 15.3%, 64.5%, 57.5% and 21.5%) following treamtne with siRNAs (siRNA34, siRNA372, siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786). Morphological analysis showed td typical morphologic changes of apoptosis such as shrunken, fragmentation nucleus as well as "apoptotic bodies" after K562 cell exposure to siRNA. Western blot analysis showed that BCR/ABL protein was reduced sharply after a single dose of 50nmol/L siRNA transfection. Conclusions: Proliferation of K562 cells was remarkbly inhibited by siRNAs (siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786) in a concentration-dependent manner in vitro, with effective induction of apoptosis at a concentration of 50 nmol/L. One anti-leukemia mechanism in K562 cells appeared that BCR/ABL targeted protein was highly down-regulated. The siRNAs (siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786) may prove valuable in the treatment of CML.