Photobiological hydrogen production using Rhodobacter sphaeroides KD131 was studied on the effect of light intensities and nitrogen sources. Media containing malate and glutamate were shown higher hydrogen production rate than that containing succinate and $(NH_4)_2SO_4$ at the $110\;W/m^2$ illumination by halogen lamp at $30^{\circ}C$. Media lacking glutamate as the nitrogen source exhibited higher hydrogen production than that containing glutamate. Initial cell concentration was optimized to 1.0 at the absorbance of 660 nm. Hydrogen production was increased by increasing the light intensity from 0 to $216\;W/m^2$ but the increasing rate declined over $108\;W/m^2$.
유기물이 많고 작물생육이 양호한 시설 및 논토양에서 우점하는 광합성 세균을 분리하여 대두박 등의 유기물질과 혼합하여 혼합유기질 비료를 개발하였고 상추에 대한 시용효과를 검토하였다. 광합성 세균은 시설 및 논토양에서 형태적으로 가장 분포도가 많은 균주를 선정하고 이를 SA16 균주로 명명하였다. 선발된 균주는 폭 $0.5{\sim}1.2{\mu}m$, 길이 $2{\sim}2.5{\mu}m$의 간균 혹은 구균에 가까운 형태로 관찰되었으며 16S rDNA 분석으로 1.3 kb DNA 단편을 얻어 염기서열을 분석한 결과 Rhodobacter sp.와 가장 유사한 것으로 나타났다. 질소기준으로 토양 검정시비 처리구와 동량인 혼합유기질비료 0.90 Mg $ha^{-1}$ 처리구는 대조구 보다 주당 엽수는 2장 정도 많았고 뿌리길이도 2 cm 정도 길었다. 혼합유기질 비료 시용량별 수확량은 $0.90{\geqq}0.45>1.35Mg\;ha^{-1}$ 순으로 많았으며 5% 수준에서 처리간에 유의성이 인정되었고 최대 수확량을 얻을 수 있는 적정 시용량을 2차 회귀곡선($y=-0.0008x^2+0.1174x+21.332,\;R^2=0.9951$)으로 구한 결과 0.72 Mg $ha^{-1}$로 나타났다. 수확 후 토양 공극율은 혼합유기질 비료1.35 Mg $ha^{-1}$ 처리구가 58.8%로 가장 좋은 것으로 나타났으며 혼합유기질 비료 처리에 따른 토양중 호기성세균의 분포는 혼합유기질 비료 0.90 및 1.35 Mg $ha^{-1}$ 처리구가 12.4, 및 $12.8{\times}10^6CFU\;g^{-1}$로 가장 높았다.
광합성 세균과 비광합성 세균에 속하는 종들 사이의 유연관계를 파악하기 위해 DNA 혼성화 방법을 실시하였다. 혼성화도는 종내 균주들 사이와 Rhodobacter capsulatus와 Rhodopseudomonas blastica 사이를(72-88%) 제외하고는 전체적으로 낮게 나타났다(2-35%). 광합성 세균 Rhodopseudommonas Palustris와 비광합성 세균 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bradyrhizobium japonicu, 사이의 D%는 광합성 세균 사이의 D%보다 약간 높게 나타났다(26-33%). Rhodopseudomonas blastica와 Rhodobacter capsulatus 사이의 D%는 72%로 유전적 유연관계가 매우 높은 것으로 나타났다.
To find out the growth conditions for the maximum activity of nitrogenase which catalyzes nitrogen fixation in Rhodobacter sphaeroides, the promoter activities of nifA and nifH were analyzed and the results indicated that expression of both nifA and nifH was increased in response to deprivation of both O2 concentration and nitrogen source. The nifA mutant was constructed by deleting the gene to investigate the effect of NifA, the transcriptional regulator, on the nifH and nifA expression in R. sphaeroides. Analysis of expression of nif genes using the nifA::lacZ and nifH::lacZ fusions in the nifA mutant revealed that NifA acts as a positive activator for nifH and an autoregulator in its own expression. The promoter activities of nifA and nifH in the prrA mutant grown under anaerobic and ${NH_4}^+$-free conditions were derepressed, comparing with those of the wild-type grown under the same conditions, indicating that the prrA product acts as a positive regulator in expression of nifA and nifH.
Photobiological $H_2$ production was compared using purple non-sulfur bacteria Rhodobacter sphaeroides KD131 in the medium containing various organic acids as the carbon source and electron doner under illumination of $110\;W/m^2$ using halogen lamp at $30^{\circ}C$. The organic acids used were 0~120 mM acetate, butyrate, lactate and malate. Initial pH 7.0 and cell concentration 1.0 at 660nm were increased to pH 8 and 4.4~5.1, respectively during 24hrs of photo-fermentation when lactate and malate were used. However, acetate and butyrate increased pH to 9 and cell concentration to 3.2~3.9 of malate at the same experimental conditions. Optimum ranges of organic acids concentration and carbon/nitrogen ratio were 30~60 mM and 10~20, respectively. When malate was used as the substrate, maximum $H_2$ production 1.1 ml $H_2$/ml broth, which is equivalent to 1.97 mol $H_2$/mol malate was observed.
한국의 서해안과 남해안 47개소의 해수와 mud 시료로부터 광합성세균으로 유추되는 13개의 균주를 분리하였고, agar-shake tube method와 RAPD-PCR을 이용하여 4종의 서로 다른 균주를 순수분리 하였다. 이들 4종의 균주 중 폐수분해능이 우수한 균주를 선정하여, 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 16S rRNA sequencing에 의한 동정을 실시하였고, 그 결과 purple, non-sulfur bacteria의 Rhodobacter 속에 가장 근접하여, Rhodobacter sp. EGH-24로 명명하였다. Rhodobacter sp. EGH-24가 생산하는 carotenoid 색소는 spheroidene(group 2)이였고, bacteriochlorophyll a를 가지고 있었으며, PHB를 생산하는 것으로 확인되었다.
Rhodobacter sphaeroides는 photoheterotrophic 조건에서 성장을 하면서 질소고정효소인 nitrogenase에 의해 수소를 발생시킨다. 이 nitrogenase는 ammonium ion이 존재할 때, PII 계열 단백질인 GlnB와 GlnK에 의해 negative regulation을 받게 된다. 본 연구에서는 glnB와 glnK 유전자를 interruption하여 수소생성의 증진을 꾀하였다. 그 결과, parental strain이나 glnB 혹은 glnK 유전자 하나만을 interruption 시켰을 경우, 암모니움 이온에 의해 nitrogenase 활성이 저해를 받고 있었으나, glnB, glnK 모두를 interruption 시켰을 때, 암모니움 이온에 의한 저해 효과가 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 또한 이러한 glnB-glnK double mutant에 nifDK gene을 in trans로 넣어 nitrogenase의 dosage를 높였을 경우, 수소 생성이 약 30% 가량 증진되었다는 것을 볼 수 있었다.
호흡전자전달계의 cytochrome bc$_1$ complex 또는 cytochrome c oxidase가 기능을 하지 않는 Rhodobacter sphaeroides mutant 내에서 pyridine nucleotide[NAD(P)H와 NAD(P)$^+$]의 농도와 redox 상태는 wild type과 비교할 때 큰 변화가 없었다. 높은 산소분압 조건에서 키운 Rhodobacter sphaeroides cbb$_3$ oxidase mutant 내에서 PrrBA two-component system에 의해서 조절되는 puf 오페론의 발현은 pyridine nucleotide나 전자전달계의 ubiquinone/ubiquinol pool의 redox 상태의 변화에 의해 유도된 것이 아니다. R. sphaeroides cytochrome bc$_1$ complex mutant를 이용하여 광합성기구 합성에 대한 cbb$_3$ cytochrome c oxidase의 억제 효과는 ubiquinone/ubiquinol pool의 redox 변화에 의해 간접적으로 일어나는 것이 아님을 증명하였다.
A transposon Tn5 mutant of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 was isolated for its impaired ability of growth on minimal medium containing ${\beta}$-hydroxybutyric acid as a sole carbon source. The mutant, R. sphaeroides S7 showed approximately 6-fold decrease in ${\beta}$-hydroxybutyrate dehydrogenase activity compared with that of wild type. In R. sphaeroides S7 the Tn5 was located in DNA region corresponding to a 4.2-kb EcoRI DNA fragment of R. sphaeroides 2.4.1 chromosome.
Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) synthase catalyzed the last enzymic step to synthesize the intracellular PHB of Rhodobacter sphaeroides. No PHB was detected when the phbC coding for PhB synthase was interrupted, and its expression was regulated at the level of transcription. The cellular PHB content increased about four- to six-fold during the growth transition from the exponential to the early stationary phase under both aerobic and photoheterotrophic conditions. The PHB content during the aerobic growth seemed to be determined by the PhB synthase activity. However, the PHB synthase activity of photoheterotrophically grown cells did not correlate with the PhB content, suggesting a photoheterotrophic regulation different from the aerobic control. Thus, the PHB content of R. sphaeroides was regulated at the transcription level only under aerobic conditions.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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