• 한국미생물·생명공학회지
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• 제34권4호
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• pp.311-317
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• 2006

식물생육을 촉진하고 고추역병균을 방제하는 다기능 PGPR 균주 Bacillus subtilis AH18 항진균성 cellulase 유전자를 PCR을 이용해 pUC18과 재조합 후 E. coli DH5$\alpha$에 cloning하여 E. coli내에 발현시켰으며, 그 형질전환 균주를 E. coli DH5$\alpha$(pCM 41)이라 명명하였고, 발현된 cellulase를 ce/H라 하였다. E. coli DH5$\alpha$(pCM 41)의 inset 부위는 B. subtilis AH18의 1,582 bp 유전자를 포함하며 cellulase의 유전자는 1,524 bp로 508개의 amino acid가 암호화된 것으로 추정되었고, CMC를 함유한 SDS-PAGE의 방법으로 약 55 kDa의 분자량을 확인하였다. B. subtilis AH18이 가지는 ce/H는 3종의 대표적인 Bacillus spp.들의 cellulase 유전자의 DNA와 아미노산 배열이 98% 이상 유사하였으며, CMC(carboxymethyl-cellulose) 뿐만 아니라, 불용성 섬유소인 Avicel, filter paper(Whatman No. 1) 특히 고추역병균인 Phytophthora capsici의 건조 cell wall도 분해하였다. 또한 colH의 cellulase는 $50^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 높았으며, 최적 pH는 pH 6.0이었다. 그리고 $AgNO_3$ 또는 $CoCl_2$ 첨가시 활성이 1.7배, 2배 정도 증가하였고 $HgC1_2$ 첨가시는 활성이 20%까지 떨어졌다. 또한 여러 화학 저해제들 중 Sodium azide 또는 Hydroxy urea는 효소 활성을 증가시켰으며, CDTA 또는 EDIA는 섬유소분해능을 감소시켰다. 이들의 결과는 고추역병균 P. capsici의 생육을 억제하는 B. subtilis AM18의 진균세포벽 용해성 cellula의 효소학적 특성을 구명한 것이라고 할 수 있다.

• 한국어병학회지
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• 제11권1호
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• pp.61-67
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• 1998

PCR을 사용하여 양식 해산어에 iridovirus 감염 여부를 신속히 진단하고자 하였다. 먼저 폐사를 유발하는 iridovirus의 genomic DNA를 pUC19 vector에 cloning한 후 이 clone들의 염기 서열을 GenBank의 염기 서열과 비교 분석하였다. 이들의 염기 서열을 기초로 하여 PCR primer를 제조한 후 PCR을 수행하였다. 정상적인 어류 세포에서는 DNA의 증폭이 일어나지 않았으나 iridovirus에 감염된 세포와 순수 분리된 iridovirus에서는 DNA의 증폭이 일어났다. 이로부터 짧은 시간 내에 폐사를 유발하는 iridovirus를 신속히 진단할 수 있음이 확인되었으며 이러한 PCR을 이용한 진단은 iridovirus의 감염을 확인할 수 있는 간단하고도 정확한 방법을 제공해준다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권2호
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• pp.117-123
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• 2003

공시균인 Saccha. erythraea IFO 13426으로부터 VB-C에 의한 erythromycin 생산 유도능이 시사된 바 있으므로, 공시균으로부터 VB-C와 특이적으로 결합하는 autoregulators 및 receptor gene을 탐색하여, EM의 생산 조절 기구를 규명하고자 하였다. 탐색의 일환으로 기존의 Streptomyce속 receptor gene의 공통배열을 primer로 이용하여 PCR을 수행하였고, 예상 크기인 120bp의 단편을 pUC19 vector에 ligation하여 E. coli DH5$\alpha$에 형질전환한 후, plasmid를 분리하여 BamHI을 처리하여 2% agarose gel에 전기영동한 결과, pUC19 (2.7kbp)외에 receptor gene PCR 산물이 120bp위치에 존재하는 것을 확인하였다. 형질전환된 plasmid로 PCR을 수행하여 염기배열을 결정한 후 해석한 결과 Streptomyces sp. 유래의 receptor gene과 유사함을 확인하였다. 따라서 Saccha. erythraea IFO 13426에는 항생물질인 erythromycin의 생산에 관여한다고 추정되는 autoregulator receptor protein을 코드하는 유전자가 존재할 것으로 예상되어 120 bp의 PCR product를 probe로 이용하여 Southern 및 colony hybridization을 통하여 3.2 kbp의 SacI 단편을 가지는 plasmid(pESG)를 제작하였고, 이를 sequencing한 결과, autoregulator receptor protein 유전자가 KpnI과 SalI을 포함하는 영역에 존재한다는 것을 알 수 있었으며 이를 EsgR이라 명명하였다. 유전자 해석 결과, EsgR은 205개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이는 기존의 autoregulator receptor proteins과 비교시 30%이상의 상동성을 나타내었으며, 기존의 autoregulator receptor prorein들이 하부의 항생물질 생합성 유전자들의 제어를 위해 보유하고 있는 helix-turn-helix DNA binding motif를 EsgR이 보유하고 있는 점에서, EsgR은 Saccha. erythraea가 보유하는 autoregulator receptor protein을 code하는 유전자로 추정되었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권6호
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• pp.319-326
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• 1994

십자화과 식물의 유용유전자를 cloning하기 위한 기초연구로서 십자화과 식물인 Armoracia rusicna의 재분화계와 형질전환계를 확립하고, gene tagging을 하기 위하여 binary vector에 삽입된 옥수수의 transposon 유전자 Ac/Ds를 도입한 결과, NAA 0.1 mg/L와 BA 1.0 mg/L를 함유한 MS 배지에서 최적의 shoot를 유기할 수 있었으며, MS 기본배지에 옮기면 쉽게 발근을 유도할 수 있었다. 옥수수의 Ac/Ds의 유전자를 잎에 형질전환시킨 결과 8-10%의 형질전환율을 보였으며, 엽병의 경우에도 4%의 형질전환 식물체가 얻어졌다. Kanamycin 100 mg/L 농도에서 선발한 개체를 PCR 분석 및 Southern blot분석을 행하였던 결과 PCR분석으로부터 Ds유전자가 식물에 도입된 것이 확인되었고, Southern blot 분석으로부터 Ac/Ds 모두가 도입된 것이 확인되었다.

• Journal of Plant Biology
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• 제37권1호
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• pp.77-83
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• 1994

종자를 자연건조시킨 상태에서 ${\beta}-glucuronidase$ (GUS) 유전자와 hygromycin phosphotransferase (HPT) 유전자를 가진 plasmid DNA 용액을 imbibition시켰다. GUS 유전자의 경우 품종, vector의 종류, imbibition의 온도에 따라 표지유전자의 발현율에 차이가 있었으며 약 30-50%의 transient expression을 나타내었다. Hygromycin B (HmB)배지에서 선별된 개체의 genomic DNA를 뽑아 외부유전자의 존재를 dot 분석을 통하여 확인하였다. Inverse polymerase chain reaction 결과 만들어지는 생성물을 cloning하고 sequencing한 결과 CaMV35S promoter sequence를 찾았다. Hygromycin이 첨가된 배지에서 선별된 개체들에서 GUS 유전자의 primer를 이용하여 PCR를 수행한 결과 20개체 중 18개체에서 GUS 유전자가 안정되게 존재하여 HmB 배지에서 GUS 유전자의 존재비율은 90%였다. 본 연구의 결과로부터 두 개의 유전자를 소유한 pYJH vector system이 고등식물의 형질전환에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제37권1호
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• pp.46-51
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• 1995

국내 분리주의 BmNPV를 이용하여 유용 단백질을 생산할 수 있는 새로운 전이벡터의 제작과 외내 유전자의 발현에 대한 연구결과는 다음과 같다. 1. PCR 기법에 의하여 다각체 단백질 유전자의 ＋1 - －194에 해당하는 promoter 부위를 증폭하고 클로닝 하였다. 2. 다각체 단백질 유전子의 5' 및 3'의 leader 부위를 promoter 부위와 함께 단계적으로 클로닝하여 전이벡터를 완성하였다. 3. 완성된 전이벡터는 pBmKSK1으로 명명하였으며, 염기서열 결정을 통하여 다각체 단백질 유전자의 ＋2 부터 ＋597까지 제거되고 외내 유전자의 클로닝 sites로 EcoRI, KpnI과 SacI을 가짐을 확인하였다. 4. 외래 유전자로서 E. coli의 $\beta$-galactosidase 유전자를 pBmKSKl에 클로닝하고 누에 세포주에 전이시킨 후, X-gal 염색 및 SDS-PAGE에 의하여 pB- mKSKl이 제 기능을 수행함을 확인하였다.

• Mycobiology
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• 제40권2호
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• pp.107-110
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• 2012

Genes encoding the cellobiohydrolase enzyme (CBHI), designated as cbhI, were isolated from the basidiomycetes Auricularia fuscosuccinea, Pleurotus giganteus, P. eryngii, P. ostreatus, and P. sajor-caju. Initially, the fungal genomic DNA was extracted using a modified cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) protocol and used as a DNA template. The cbhI genes were then amplified and cloned using the pGEM-T Easy Vector Systems. The sizes of these PCR amplicons were between 700~800 bp. The DNA sequences obtained were similar showing high identity to the cbhI gene family. These cbhI genes were partial consisting of three coding regions and two introns. The deduced amino acid sequences exhibited significant similarity to those of fungal CBHI enzymes belonging to glycosyl hydrolase family 7.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권1호
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• pp.29-36
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• 2007

The xynA gene encoding the xylanase A of Paenibacillus sp. DG-22 was isolated with a DNA probe obtained by PCR amplification, using degenerated primers deduced from the amino acid residues of the known N-terminal region of the purified enzyme and the conserved region in the family 11 xylanases. The positive clones were screened on the LB agar plates supplemented with xylan, by the Congo-red staining method. The xynA gene consists of a 630-bp open reading frame encoding a protein of 210 amino acids, and the XynA preprotein contains a 28-residues signal peptide whose cleavage yields a l82-residues mature protein of a calculated molecular weight of 20,000Da and pI value of 8.77. The cloned DNA fragment also has another ORF of 873 nucleotides that showed 76% identity to the putative transcriptional activator of Bacillus halodurans C-125. Most of the xylanase activity was found in the periplasmic space of E. coli. The xynA gene was subcloned into pQE60 expression vector to fuse with six histidine-tag. The recombinant xylanase A was purified by heating and immobilized metal affinity chromatography. The optimum pH and temperature of the purified enzyme were 6.0 and $60^{\circ}C$, respectively. This histidine-tagged xylanase A was less thermostable than the native enzyme.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제53권3호
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• pp.335-339
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• 2015

Cryptosporidium andersoni ATP-binding cassette (CaABC) is an important membrane protein involved in substrate transport across the membrane. In this research, the nucleotide binding domain (NBD) of CaABC gene was amplified by PCR, and the eukaryotic expression vector of pEGFP-C1-CaNBD was reconstructed. Then, the recombinant plasmid of pEGFP-C1-CaNBD was transformed into the mouse intestinal epithelial cells (IECs) to study the iron transportation function of CaABC. The results indicated that NBD region of CaABC gene can significantly elevate the transport efficiency of $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $K^+$, and $HCO_3{^-}$ in IECs (P<0.05). The significance of this study is to find the ATPase inhibitors for NBD region of CaABC gene and to inhibit ATP binding and nutrient transport of CaABC transporter. Thus, C. andersoni will be killed by inhibition of nutrient uptake. This will open up a new way for treatment of cryptosporidiosis.

• 미생물학회지
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• 제48권2호
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• pp.141-146
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• 2012

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 대장균에 클로닝하였다. Xylanase 유전자는 211 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 633 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 xylanase는 glycosyl hydrolase family 11에 속하며 Paenibacillus의 xylanase와 85-89% 상동성을 보였다. Xylanase 유전자를 T7 promoter로 과잉발현한 결과 그 발현량이 높지 않았으며, 균체내 외에서 모두 효소활성이 관찰되었다. 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 사용하여 효소 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였다. 한편 xylanase의 기질로 xylan과 xylooligosaccharides를 사용하였을 때 xylose와 xylotriose가 주된 최종 반응산물로 관찰되었으며 xylobiose는 분해하지 못하였으나 이보다 중합도가 큰 xylooligosaccharides는 분해하였다.