• 한국수산과학회지
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• 제19권6호
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• pp.547-557
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• 1986

전보(Pyeun and Kim, 1986)에서와 같이 고등어 유문수조직에서 정제한 3종의 알칼리성단백질분해효소에 대하여 활성최적조건, 열안정성. 기질친화도, 화학약제에 대한 영향 및 분자량 등을 규명하였다. 각 정제효소의 반응최적조건을 기질별로 검토한 결과, casein에 대하여 Enz. A는 pH 9.4, Enz. B와 Enz. C는 pH 9.8이었으며, Hb에 대하여 Enz. A는 pH 9.2, Enz. B는 pH 10.2, 그리고 Enz. C는 pH 9.8이었고, 최적반응온도는 공히 $45^{\circ}C$였다. 효소농도 $2{\mu}g/ml,\;2\%$ casein 기질의 반응조건에서 반응시간(x)에 대한 활성도 (y)의 관계를 분석한 결과, Enz. A는 60분. Enz. B는 40분, 그리고 Enz. C는 50분까지 1차 반응의 관계가 성립하였으며, 이때의 반응속도식은 Enz. A는 y=3.6x, Enz. B는 Y=6.0x, 그리고 Enz. C는 y=4.2x였다. 열안정성을 검토하기 위하여 $50^{\circ}C$에서 5분간 가열했을때, Enz, A는 $90\%$, Enz. B는 $33\%$, 그리고 Enz. C는 $37\%$가 각각 불활성화하였다. Lineweaver-Burk의 도식에 의한 효소의 기질친화도를 측정한 결과, casein기질에 대하여 Enz. A는 Km이 $5.0{\times}10^{-3}\%$, Enz. B는 Km이 $1.0{\times}10^{-3}\%$, 그리고 Enz. C는 Km이 $3.6{\times}10^{-3}\%$였다. 금속 ion에 의한 영향을 검토한 결과, $Ag^+,\;Hg^{2+}$는 효소활성을 저하시켰으나, $Mn^{2+},\;Sn^{2+}$ 및 $Pb^{2+}$ 이온은 활성을 증가시켰다. Enz. B와 Enz. C는 soybean trypsin inhibitor에 의해 상당히 저해되었다. 따라서 효소 B와 C는 serine 계 단백질분해효소로 판단되었다. SDS-PAG 전기영동과 Sephadex G-100 겔 여과법에 의하여 각 정제효소의 분자량을 측정한 결과, Enz. A는 $27,500{\pm}2.500$, Enz. B는 $20,500{\pm}1,500$, 그리고 Enz. C는 $15,250{\pm}250$이었다.

• 한국식품과학회지
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• 제30권3호
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• pp.709-716
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• 1998

양송이의 알칼리 추출물에서 면역계의 주요인자인보체계와 macrophage를 활성화시키는 다당들을 분리, 정제하고 구조적 특성을 비교하였다. AB-20-IVa-2는 항보체 활성과 macrophage 활성능을 동시에 나타내는 단백다당으로 주요 구성당은 glucose > galactose > mannose 순으로 함유되어 있고 주요 구성아미노산은 phenylalanine (34.72%)과 valine (27.84%)이었다. AB-20-Ia와 AB-20-IIa-2a는 macrophage 활성을 갖고 있는 순수다당으로 AB-20-Ia의 주요 구성당은 glucose > xylose > mannose이고 AB-20-IIa-2a는 xylose > glucose > mannose이었다. AB-20-Ia, AB-20-IIa-2a, AB-20-IVa-2의 분자량은 각각 84만, 75만, 65만 정도로 추정되었다. AB-20-Ia, AB-20-IIa-2a, AB-20-IVa-2의 구조적 특성을 비교하기 위하여 NMR 분석, methyl화 분석을 통해 anomer 배위 양식과 당쇄 결합 양식을 조사하였다. AB-20-Ia는 ${\beta}-anomer$ 형태로 존재하는데 비해서 AB-20-IIa-2a는 ${\alpha}-$와 ${\beta}-anomer$ 모두 확인되었으며 ${\beta}-$의 비율이 좀 더 높았다. 또, AB-20-Ia와 AB-20-IIa-2a 모두 구성당 잔기에 acetyl기가 존재하였으며 특히, macrophage 활성능이 더 강한 AB-20-IIa-2a에 더 높은 비율로 함유되어 있었다. 이 정제 다당들의 당쇄 결합양식은 AB-20-Ia는 주로 ${\beta}-1,6-linked\;glucofuranosyl$ 잔기가 주쇄를 구성하고 있고, AB-20-IIa-2a는 1,6-linked glucopyranosyl 잔기가 주쇄를 이루고 여기에 측쇄들이 1,4 결합으로 연결된 다당으로 추정되었다. 또, AB-20-IVa-2는 1,2-linked xylofuranosyl 잔기와 1,6-linked glucopyranosyl 잔기가 주쇄를 이루고 이 xylofuranosyl 잔기에 측쇄들이 1,3 결합으로 연결된 다당으로 추정되었다.

• 한국응용곤충학회지
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• 제47권2호
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• pp.175-184
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• 2008

국내의 난방제 해충에 선택적으로 생물활성을 나타내는 균주를 선발하기 위하여 작물재배 지역의 토양으로부터 채취한 115개의 토양샘플 중 46개의 Bacillus thuringiensis 균주를 분리하였다. 이러한 B. thuringiensis균주를 사용하여 난방제 농업해충에 생물활성을 검정한 결과 배추좀나방(Plutella xylostella)에 CAB119을 포함한 35균주, 파밤나방(Spodoptera litura)에는 CAB128, CAB141균주가, 담배거세미나방(Spodoptera exigua)은 CAB133과 CAB159균주가 효과를 나타냈으며 CAB162균주는 3종류의 모든 해충에 높은 활성을 보였다. 분리된 B. thuringiensis CAB133 균주는 H serotype에 의한 혈청학적 동정과 SDS-PAGE를 통한 독소 단백질 패턴에서 B. thuringiensis subsp. kurstaki (3abc)로 동정되었다. 담배거세미나방 2령 유충에 대한 활성검정의 결과 B. thuringiensis subsp. kurstaki (3abc) CAB133, CAB162의 두 균주에 대한 $LD_{50}$ 값은 각각 0.089, $3.144{\mu}g/ml$로 높은 활성을 나타났다. 담배거세미나방의 령기에 따른 생물실험에서 CAB133 균주 $1.5{\times}10^6(cfu/ml)$에서 1령의 경우 3일, 2령은 5일에 100%의 사충율을 보였다. 담배거세미나방의 경우 B. thuringiensis를 섭식 후 먹기를 중단하여 성장이 멈추면서 $5{\times}7$일 후에 사망하였다. 그러므로 B. thuringiensis의 결정성독소단백질$(1.267{\mu}g/ml)$를 섭식하고 성장하지 못하는 담배거세미나방 유충의 무게는 대조군보다 5일후 약 30배정도 차이로 나타나서 사망하였다.

• 생명과학회지
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• 제16권7호
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• pp.1133-1140
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• 2006

E. coli HtrA (High temperature requirement protein A)의 human homologue 중 하나인 HtrA1은 IGFBP를 절단하여 IGF의 활동을 조절하는 serine protease으로 알려졌다. HtrA1의 serine protease 활성이 여러 질병의 발병 mechanism과 연관성을 가진 것으로 예상되고 있지만, 이런 상관관계를 밝히기 위해서 기본적으로 필요한 다량의 HtrA1 단백질의 발현 및 정제조건과 HtrA1 serine protease의 최적 활성조건이 확립되어 있지 않은 상황이다. 따라서 본 연구에서는 pGEX 시스템을 이용하여 E. coli에서 mature HtrA1인 ${\Delta}149(WT)$와 catalytic site mutant인 ${\Delta}149(S328A)$를 85%의 순도로 1 liter 배양 시, 정제된 단백질을 각각 $400{\mu}g,\;520{\mu}g$ 얻을 수 있는 발현조건을 정립하였다. 또한 HtrA1 serine protease 활성은 protease의 농도와 substrate와의 반응시간에 dependent하며, substrate와의 반응온도가 $42^{\circ}C$일 때 최적의 serine protease활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히 $200{\mu}M$의 HtrA1 serine protease를 $37^{\circ}C$에서 3시간 반응 시켰을 때, substrate로 사용한 ${\beta}-casein$의 약 50%가 절단되는 것을 관찰하였다. 따라서 이 반응조건에 사용한 HtrA1의 양을 1 unit으로 하여 HtrA1의 serine protease활성을 여러 조건에서 비교 분석할 수 있다 본 연구에서 정립한 mature HtrA1을 다량으로 얻을 수 있는 발헌 및 정제조건과 serine protease 최적 활성조건은 HtrA1의 serine protease 활성과 생물학적 기능의 상관관계를 이해하는데 활용될 수 있을 것이다.

• 생명과학회지
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• 제19권7호
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• pp.994-1002
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• 2009

수집한 간장시료에서 형태학적인 특성에 따라 상이한 30주의 미생물을 분리하고 MRS 액체배지에서 $37^{\circ}C$, 24시간 배양한 후 회수한 배양 상등액 중 paper disc법으로 항균활성이있는 것을 일차 선별하여 proteinase K 처리에 의해 항균활성이 사라지는 시료 하나를 최종적으로 선별하였다. 선별한 분리주를 생화학적 분류와 분자계통학적 분류를 통해 동정한 결과 B. lichenifirnus로 나타났다. 이 균주의 생장온도와 배지의 초기 pH 에 따른 세포생장 및 박테리오신 활성을 조사한 결과 배양온도는 $37^{\circ}C$, 배지의 초기 pH는 7.0에서 박테리오신의 활성이 가장 높게 나타났다. B. lichenifirnus가 생산하는 박테리오신은 Bacill sogaerucey, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantaum, Micrococcus Iateus, Paenibacillus polymyxa 및 Pediococcus dextrinicus 등에 대해서 항균활성을 보였으며, pH 3.0${\sim}$11.0에 이르는 거의 전 pH 영 역에서 20시간 이상 처리하여도 그 항균활성을 완전히 잃지 않아 비교적 넓은 pH 범위 내에서 안정함을 알 수 있었다. Acetone, acetonitrile, chloroform, ethanol 처리 및 $20{\sim}100^{\circ}C$C에서 60분간 가열시에도 높은 항균활성을 유지하였다. 여러 가수분해효소에 대한 내성을 조사한 결과 trypsin, a-chymotrypsin, pepsin, a -amylase 및 carboxypeptidase A 등은 항균활성에 영향을 주지 않았으나 lipase는 항균활성을 약간 감소시켰으며 proteinase K는 항균활성을 완전히 사라지게 하였다. 75% 황산암모늄 침전, 양이온교환크로마토그래피, 역상 HPLC 등의 과정을 통해 정제된 박테리오신의 상대비활성(specific activity)은 배양상등액에서 보다 약 75배 증가하였고 회수율은 13.5%였다. 역상 HPLC를 통해서 정제된 박테리오신의 분자량을 tricine SDS-PAGE을 통해서 확인한 결과 약 2.5 kDa으로 나타났으며 염색 시 단일 band로 나타나 순수하게 정제되었음을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제52권2호
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• pp.192-201
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• 2016

최근 북극해의 축치해(Chuckchi Sea)로부터 저온지질분해 효소활성을 보이는 Psychrobacter sp. ArcL13 균주가 분리되었다. 그러나 낮은 발현 양 때문에, 이 효소의 다양한 분야에서의 활용에 제약을 받아왔다. 따라서 유전자 재조합 기술을 이용하여, 이 효소를 대량생산하는 기술개발이 필요하였다. 재조합 지질분해효소를 만들기 위해서는 우선 해당 유전자의 동정이 필요하였기 때문에, Psychrobacter sp. ArcL13 균주로부터 PCR을 이용한 gene prospecting 방법으로 새로운 지질분해효소 유전자인 ArcL13-Lip을 분리하고 전체 염기 서열을 규명하였다. 염기 서열 분석결과 ArcL13-Lip은 일부 Psychrobacter 속 박테리아 유래의 지질분해효소들과 염기 서열의 유사성은 낮지만, 84-90%의 아미노산 서열 유사성을 보였다. ArcL13-Lip 전체 유전자를 대장균에서 발현시키고 전기영동으로 분석한 결과, 재조합 ArcL13-Lip은 약 35 kDa의 분자량을 보였으며 단백질 봉입체 형태로 발현되었다. Unfolding된 ArcL13-Lip을 다양한 첨가물이 포함된 완충용액에서 refolding 시킨 결과, glucose에 의해서 refolding 효율이 가장 크게 증가하였다. Refolding된 재조합 ArcL13-Lip은 다양한 p-nitrophenyl ester 중 p-nitrophenyl caprylate과 p-nitrophenyl decanoate에 대해 가장 높은 효소활성을 보였다. 온도에 따른 효소활성을 조사한 결과 ArcL13-Lip은 $40^{\circ}C$에서 최고의 활성을 나타내었고, $10^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$에서 각각 최고 활성 대비 약 40%와 73%의 효소활성을 나타내었다. 이와 같이 ArcL13-Lip은 전형적인 저온활성 효소의 특징을 보여주었다.

• 미생물학회지
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• 제45권4호
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• pp.332-338
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• 2009

꿀벌(Apis mellifera)의 장으로부터 xylan분해능이 우수한 세균 HY-20을 분리하였고, Bacillus 속으로 동정하였다. 분리균주 HY-20의 세포 외 GH11 xylanase (XylP) 유전자 (687-bp)는 25,522 Da의 분자량과 9.33의 pI 값을 갖는 228개의 아미노산으로 구성된 단백질을 인코딩하는 것으로 확인되었으며, 지금까지 특성규명이 이루어지지 않은 B. pumilus xylanase (GenBank accession no.: AY526092)의 아미노산 서열과 97%의 상동성을 보였다. pET-28a(+)/xylP를 포함하고 있는 Escherichia coli BL21 균주에서 과발현 된 His-tagged XylP (rXylP)는 cation exchange 및 gel permeation chromatography를 통해 순수하게 분리 정제 되었으며, $50^{\circ}C$의 온도와 pH 6.5 조건에서 반응할 때 birchwood xylan에 대해 가장 높은 가수분해 활성을 나타내었다. rXylP는 15분간 $55^{\circ}C$에 노출될 때 본래 활성의 약 50%를 잃어버리는 전형적인 중온성 효소의 특성을 보였으며, $Hg^{2+}$ (1mM)와 N-bromosuccinimide (5mM)에 노출될 때 완전히 불활성화 되었고, $Mn^{2+}$ (1 mM), $Fe^{2+}$ (1mM) 및 sodium azide (5 mM)에 의해서는 활성이 약 10% 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 한편, rXylP는 xylose유래 다당류는 효율적으로 분해하였지만 PNP-sugar 유도체 및 glucose 유래 다당류는 분해하지 못하였다.

• 대한환경공학회지
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• 제28권11호
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• pp.1213-1221
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• 2006

본 연구에서는 혐기성 암모늄 산화(ANAMMOX)반응을 유도하기 위해 양조폐수를 처리하는 메탄 생성 반응조의 입상 슬러지를 혐기성 반응기에 식종하였다. 암모니아성 질소($NH_4^+-N$)와 아질산성 질소($NO_2^--N$)를 1:1의 비율로 인공폐수를 조제하여 반응조를 운전하였다. 실험기간은 반응기의 유입 질소농도 조건에 따라 3개의 phase로 구분하였다. 각 phase별 유출수의 질소농도, COD, 알칼리도, 발생 가스 조성을 측정하여 처리효율을 평가하였다. Phase 1에서는 유입 $NH_4^+$-N $NO_2^-$-N를 각각 1.91 $gN/m^3{\cdot}d$부터 14.29 $gN/m^3{\cdot}d$까지 점차 높였으며 Phase 2에서 각 질소의 부하를 23.81 $gN/m^3{\cdot}d$, Phase 3에서는 19.05 $gN/m^3{\cdot}d$로 하여 운전하였다. 아질산성 질소($NO_2^-$-N)는 전 기간에 걸쳐 99%까지 제거 되었으며, 암모니아성 질소($NH_4^+-N$)의 제거율은 각 phase별로 변동폭이 높았으며 이 중 Phase 2에서 최대 75%까지 제거되었다. 한편 각 phase별 반응조의 미생물 군집 변화는 16s rDNA방법을 이용하여 분석하였다. 입상 슬러지의 접종 초기인 Phase 1의 경우 메탄생성이 일정하게 유지되었으며 메탄균과 탈질균이 공존하였다. Phase 2의 경우 아질산성 질소($NO_2^--N$)와 암모니아성 질소($NH_4^+-N$)의 제거율이 각각 99%와 75%까지 증가하였으며 이 때 ANAMMOX균의 존재가 확인되었다. Phase 3의 경우 외부 공기 유입으로 인하여 암모니아성 질소(NH4+-N)의 제거율은 급격히 감소하였으나 미생물 군집 중 여전히 ANAMMOX균이 관측되었다.

• 식물병연구
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• 제14권1호
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• pp.15-20
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• 2008

산박하(Isodon inflexus)의 Is-CMV, 깽깽이풀(Jeffersonia dubia)의 Jd-CMV 및 파리풀(Phryma leptostachya var. asiatica)의 Pla-CMV 등, 3종의 잡초에서 분리한 Cucumber mosaic virus(CMV)를 공시하여, 기주반응 실험, dsRNA 분석, 혈청학적 성질조사, RT-PCR및 RFLP등의 실험을 통하여 각 바이러스를 동정하고, 특성을 구분하였다. 잡초로부터 분리 한 3종의 CMV는 Nicotiana benthamiana, N. tabacum cv. Xanthi nc, N. glutinosa, Cucubita pepo cv. Black Beauty에는 모두 유사한 모자이크 병징을 발현하였으며, Chenopodium amaranticolr와 Vigna unguiculata cv. Kurotanesanzaku에서는 국부 괴사병반이 발현되었다. 한편 고추(Capsicum anmuum cv. Chungyang)에서는 Jd-CMV와 Pla-CMV는 전형적인 모자이크 증상을 발현하였으나, Is-CMV는 병징이 나타나지 않고 무병징으로 감염되는 특성을 보였다. Is-CMV, Jd-CMV 및 Pla-CMV에 감염된 N. benthamiana로부터 추출한 dsRNA는 모두 약 3.4, 3.2, 2.1 및 1.0kbp의 분자크기를 갖는 4종의 dsRNA 밴드가 검출되었으며, 대조로 이용한 Fny-CMV의 dsRNA 패턴과 같았다. Is-CMV, Jd-CMV 및 Pla-CMV에 감염된 N. benthamiana의 즙액을 항원으로 이용하여 Fny-CMV의 항혈청과 한천겔이중확산법으로 조사한 혈청학적 실험 결과는 모든 항원이 한 종의 뚜렷한 침강선을 형성 하였으며, Fny-CMV의 항원에 의해서 형성된 침강선과 융합함으로서 서브그룹 I에 속하는 계통들로 판단되었다. 또한 Is-CMV, Jd-CMV 및 Pla-CMV에 감염된 N. benthamiana로부터 추출한 RNA를 이용하여 CMV-specific 프라이머를 이용한 외피단백질유전자를 포함하는 RNA3의 3' 영역 에 대한 RT-PCR을 실시한 결과, Fny-CMV와 마찬가지로 약 950bp 크기의 cDNA가 증폭되었다. 증폭된 각각의 cDNA를 EcoRI으로 처리하였을 때에는 절단되지 않았으며, HindIII, MspI, SalI 그리고 XhoI에서는 2개의 절편으로 절단되었다. 이와 같은 결과는 Fny-CMV의 절단패턴과 일치하는 것으로 Is-CMV, Jd-CMV 그리고 Pla-CMV는 서브그룹 IA에 속하는 계통으로 확인되었다. 이들 3종의 잡초로부터 CMV가 분리 동정된 것은 이 논문이 처음이다.

• 한국식품과학회지
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• 제46권3호
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• pp.334-340
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• 2014

즉석섭취 편의식품은 일반적으로 소비자가 별도의 조리과정 없이 직접 신선한 상태로 섭취하기 때문에 병원성 미생물에 오염되어 있을 경우 식중독을 일으킬 수 있다. 특히 B. cereus는 자연계에 널리 분포하여 대부분의 식품에 쉽게 오염되어 식중독을 유발 시킬 수 있는 독소형 식중독균 중의 하나이다. 이에 본 연구는 유통 판매중인 즉석섭취 편의식품류 및 식중독이 발생하여 의뢰된 보존식에서 B. cereus의 분리율 및 독소 종류의 분포형태를 파악하였다. 식품 총 619건 중 263건(42.5%)의 B. cereus를 분리하였지만, 식품의약품안전처의 식품공전에서 즉석섭취 편의식품류에 대한 B. cereus에 대한 규격기준이 1,000 CFU/g 이하로, 본 실험에서는 규정 범위를 초과한 식품은 없었다. B. cereus 총 263개 분리균주에 대한 9종류의 장내독소 및 1종류의 구토독소를 분석한 결과, NHE complex (nheA, nheB, nheC)중 3개의 nhe 유전자를 모두 보유한 B. cereus는 236개 균주(89.7%), 1개만의 독소를 가지고 있는 균주는 2개(0.8%)뿐이었다. 또한, HBL complex (hblA, hblB, hblD) 중 3개의 hbl 유전자를 보유한 균주는 175개 균주(66.5%), 그리고 한개 혹은 두 개의 hbl 유전자를 가진 균주는 59개 균주(21.7%), 3개 유전자를 모두 가지고 있지 않은 균주는 29개 분리균주(11.0%)로 나타났다. NHE complex 유전자의 빈도가 HBL complex 유전자 보다 더 높게 나타나는 특징을 확인할 수 있었다. 장내독소 entFM, $cytK_2$, bceT 유전자의 보유율은 각각 100, 100, 43.0% 순으로 확인되었다. B. cereus의 구토 독소인 CER 유전자는 평균 50.2%를 보유하고 있었으며, 식품유형에 따라 식중독 보존식, 즉석섭취 식품, 편의식품에서 각각 100, 59.4, 35.6% 순으로 나타났다. 식품 중 분리한 B. cereus가 산생하는 구토독소를 가지고 있는 B. cereus 균주 중 29.4%에서 8개의 장내독소를 보유하고 있었으며, 나머지 균주들도 대부분 5-8개의 장내독소를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구 결과를 종합해보면, 식품에서 분리한 B. cereus는 대부분의 균주가 설사형 및 구토형 독소를 보유하고 있어, 즉석 섭취 편의식품의 미생물 오염 요인들은 계절에 관계없이 지속적으로 위생적인 관리가 필요할 것으로 사료된다. 또한, 식품의 미생물적 안전성 확보를 위해서는 업체의 생산단계부터 저장 및 운반을 포함한 유통단계 등에서 식중독을 유발 할 수 있는 오염원들이 내재되어 있기 때문에 철저한 개인 및 환경 위생관리가 필요할 것으로 사료된다.