The ermK gene from Bacillus lichenformis encodes an inducible rRNA methylase that confers resistance to the macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. The ermK mRNA leader sequence has a total length of 357 nucleotides and encodes a 14-amino acid leader peptide together with its ribosome binding site. The secondary structure of ermK leader mRNA and a leader peptide sequence have been reported as the elements that control expression. In this study, the contribution of specific leader peptide amino acid residues to induction of ermK was studied using the PCR-based megaprimer mutation method. ermK methylases with altered leader peptide codons were translationally fused to E. coli ${\beta}-galactosidase$ reporter gene. The deletion of the codons for Thr-2 through Ser-4 reduced inducibility by erythromycin, whereas that for Thr-2 and His-3 was not. The replacement of the individual codons for Ser-4, Met-5 and Arg-6 with termination codon led to loss of inducibility, but stop mutation of codon Phe-9 restored inducibility by erythromycin. Collectively, these findings suggest that the codons for residue 4, 5 and 6 comprise the critical region for induction. The stop mutation at Leu-7 expressed constitutively ermK gene. Thus, ribosome stalling at codon 7 appears to be important for ermK induction.
Kim, Jeong-A;Min, Yu-Hong;Yun, Hee-Jeong;Lim, Jung-A;Lee, Sang-Won;Kim, ung-Hoon;Park, Eung-Chil
대한약학회:학술대회논문집
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대한약학회 2002년도 Proceedings of the Convention of the Pharmaceutical Society of Korea Vol.2
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pp.335.1-335.1
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2002
The ermK gene from Bacillus lichenformis encodes an inducible rANA methylase that confers resistance to the macrolide-lincosamide-streptograminB antibiotics. The ermKmANA leader sequence has a total length of 357 nucleotides and encodes a 14-amino acid leader peptide together with its ribosome binding site. The secondary structure of erm leader RNA and a leader peptide have been reported as the elements that control expression. (omitted)
More effective production of human insulin is important, because insulin is the main medication that is used to treat multiple types of diabetes and because many people are suffering from diabetes. The current system of insulin production is based on recombinant DNA technology, and the expression vector is composed of a preproinsulin sequence that is a fused form of an artificial leader peptide and the native proinsulin. It has been reported that the sequence of the leader peptide affects the production of insulin. To analyze how the leader peptide affects the maturation of insulin structurally, we adapted several in silico simulations using 13 artificial proinsulin sequences. Three-dimensional structures of models were predicted and compared. Although their sequences had few differences, the predicted structures were somewhat different. The structures were refined by molecular dynamics simulation, and the energy of each model was estimated. Then, protein-protein docking between the models and trypsin was carried out to compare how efficiently the protease could access the cleavage sites of the proinsulin models. The results showed some concordance with experimental results that have been reported; so, we expect our analysis will be used to predict the optimized sequence of artificial proinsulin for more effective production.
It has been found that a number of diseases are associated with mutations in the mitochondrial DNA. Therapeutic gene delivery to mitochondria has been suggested as a clinical option for these diseases. In this study, we developed a gene carrier to mitochondria by the conjugation of mitochondrial leader peptide (LP) to polyethylenimine (PEI). Mitochondrial LP conjugated PEI (PEI-LP) was synthesized with low molecular weight PEI (2,000 Da, PEI2K). Gel retardation assay showed that PEI2K-LP formed complexes at a 1.0/1 weight ratio. In addition, PEI2K-LP protected DNA from the enzymatic degradation for at least 60 min, while naked DNA was completely degraded within 20 min. PEI2K-LP was compared with LP conjugated high molecular weight PEI (25,000 Da, PEI25K) in terms of toxicity and delivery efficiency. MTT assay showed that PEI2K-LP had much lower cytotoxicity than PEI25K-LP to 293 cells. In addition, cell-free DNA delivery assay showed that PEI2K-LP delivered more DNA to mitochondria at a 1.8/1 weight ratio than naked DNA or PEI. This result suggests that PEI2K-LP may be useful for the development of mitochondrial gene therapy system with lower cytotoxicity.
지속성 및 유발성 발한의 두 macrolide-lincosamide-streptogramin B 저항성 인자가 한 Staphylococcus aureus DHI 균주의 염색체 DNA 및 plasmid pDE1(7.4kb)로부터 각각 분리되었다. pDE1상의 유발성 Em 저항성 인자의 염기서열은 이미 보고 된 바 있는 pE194상의 ermC와 동일하였으며 지속성 Em 저항성 인자의 경우는 그 제한효소 인식부위의 mapping 결과로 보아 ermCdb전자에서 유발성 기구에 관여하는 leader peptide 부위가 결여된 인자인 것으로 밝혀졌다.
Background: This study was aimed to differentiate two forms of CTLA-4 (CD152) in activated peripheral blood lymphocyte and clarify the mechanism how cytoplasmic form of this molecule is targeted to cell surface. Methods: For this purpose we generated 2 different anti-human CD152 peptide antibodies and 5 different N'-terminal deletion mutant CTLA4Ig fusion proteins and carried out a series of Western blot and ELISA analyses. Antipeptide antibodies made in this study were anti-CTLA4pB and anti-CTLA4pN. The former recognized a region on extracellular single V-like domain and the latter recognized N'-terminal sequence of leader domain of human CD152. Results: In Western blot, the former antibody recognized recombinant human CTLA4Ig fusion protein as an antigen. And this recognition was completely blocked by preincubating antipeptide antibody with the peptide used for the antibody generation at the peptide concentration of 200 ug/ml. These antibodies were recognized human CD152 as a cytoplasmic sequestered- and a membrane bound- forms in phytohemagglutinin (PHA)-stimulated peripheral blood lymphocyte (PBL). These two forms of CD152 were further differentiated by using anti-CTLA4pN and anti-CTLA4pB antibodies such that former recognized cytosolic form only while latter recognized both cytoplasmic- and membraneforms of this molecule. Furthermore, in a transfection expression study of 5 different N'-terminal deletion mutant CTLA4Ig, mutated proteins were secreted out from transfected cell surface only when more than 6 amino acids from N'-terminal were deleted. Conclusion: Our results implies that cytosolic form of CTLA-4 has leader sequence while membrane form of this molecule does not. And also suggested is that at least N'-terminal 6 amino acid residues of human CTLA-4 are required for regulation of targeting this molecule from cytosolic- to membrane- area of activated human peripheral blood T lymphocyte.
Park, In-Jae;Rhee, Young-Ha;Cho, Nam-Young;Shin, Kwang-Soo
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제16권12호
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pp.1935-1939
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2006
The gene encoding the extracellular medium-chain-length poly(3-hydroxyalkanoate) (MCL-PHA) depolymerase of Pseudomonas luteola Ml3-4, $phaZ_{plu}$, was cloned and analyzed. It was found to be 849 bp, with a deduced protein of 282 amino acids, and was revealed to have a typical leader peptide at its N terminus. The amino acid sequence of $PhaZ_{plu}$ revealed relatively low identity (69 to 72%) with those of other Pseudomonas MCL-PHA depolymerases. In comparison with the amino acid sequences of all available MCL-PHA depolymerases, the depolymerase was found to consist of three domains in sequential order; signal peptide, an N-terminal substrate binding domain, and a catalytic domain, indicating that $PhaZ_{plu}$ belongs to the type IV depolymerases family. The enzyme also contained Asn as an oxyanion hole amino acid.
The cDNA of endo-1,$4-{\beta}-xylanaseA$, isolated from Phaenerocheate chrysosporium was expressed in Pichia pastoris. Using either the intrinsic leader peptide of XynA or the ${\alpha}$-factor signal peptide of Saccharomyces cerevisiae, xylanaseA is efficiently secreted into the medium at maximum concentrations of 1,946 U/L and 2,496 U/L, respectively.
Lee, Sang Jun;Han, Yun Hee;Nam, Bo Hye;Kim, Young Ok;Reeves, Peter R.
Molecules and Cells
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제26권1호
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pp.34-40
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2008
To express an increased level of recombinant Mefp1 (marine mussel adhesive protein) in soluble form, we constructed expression vectors encoding truncated OmpA signal peptide-Mefp1 fusion proteins. OmpA signal peptide (OmpASP) is the 21 residue peptide fragment of the 23 residue OmpA signal sequence cleavable by signal peptidase I. We successfully produced increased levels of soluble recombinant Mefp1 (rMefp1) with various deletions of OmpASP, and found that the increased expression was caused by the increased pI of the N-terminus of the fusion proteins (${\geq}10.55$). All the OmpA signal peptide segments of 3-21 amino acids in length had the same pI value (10.55). Our results suggest that the pI value of the truncated OmpASP ($OmpASP_{tr}$) play an important role in directional signaling for the fusion protein, but we found no evidence for the presence of a secretion enhancer in OmpASP. For practical applications, we increased the expression of soluble rMefp1 with $OmpASP_{tr}$ peptides as directional signals, and obtained rMefp1 with the native amino terminus (nN-rMefp1) using an $OmpASP_{tr}$ Xa leader sequence that contains the recognition site for Xa protease.
SAMDC는 폴리아민 생합성 과정에서 주효소로 작용하며 항상성을 유지하기위해 정교하게 조절된다. 카네이션 SAMDC 유전자는 5'-leader sequence에 54개 아미노산으로 구성된 small uORF가 존재한다. Translation 과정을 조절하는 uORF의 작용기작을 연구하기 위하여 35S 프로모터에 SAMDC 유전자의 uORF 부위와 GUS 유전자를 재조합한 형질전환 담배 식물체를 이용하였다. 본 실험에서는 SAMDC uORF 염기서열 혹은 SAMDC uORF 단백질에 의해서 downstream GUS ORF의 translation이 억제되었다. 특히 translation 억제는 개시코돈이 point-mutation된 construct에서 효과적으로 이루어졌다. 따라서 이러한 결과는 ribosomal stalling이 translation 억제 과정에 관여한 것으로 사료된다. 개시 코돈과 종결코돈을 가진 SAMDC uORF의 아미노산 서열을 frame shift 시키면 GUS 활성이 증가하였는데 이는 translation inhibitor로서 작용할 때 아미노산 서열이 중요하다는 것을 의미하며, 결국은 SAMDC uORF의 단백질 구조가 중요하게 작용할 가능성을 제시한다. 또한 유식물과 담배 꽃 등의 in vivo 상에서도 GUS 발현을 조직화학적으로 분석했을 때 small uORF가 존재할 경우 GUS 염색이 크게 저하되었지만, 개시코돈이나 혹은 종결코돈이 제거되도록 point-mutation 시킨 construct가 도입된 형질전환식물체에서는 SAMDC uORF의 억제효과가 크게 완화 되었다. 또한 가장 중요한 관찰 결과로는 small uORF 염기서열로부터 in vitro 시스템에서 5.7 kDa의 단백질이 실제적으로 합성되었음을 관찰하였다. 폴리아민 처리 후 GUS 단백질이 억제된 결과는 uORF로부터 합성된 단백질이 폴리아민 뿐 만 아니라 translation 과정에 관여하는 다른 요소들과 상호작용을 이루어 조절될 수 있음을 암시한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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