본(本) 실험(實驗)은 세균(細菌)에 의한 L-threonine의 효율적인 생성(生成)을 검토할 목적(目的)으로 Brevibacterium flavum ATCC 14067을 사용하여 L-threonine 생성능(生成能)이 우수한 균수(菌株)를 선발(選拔)하기 위해 변이원인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG)로 처리하여 돌연변이주(突然變異株)를 유도(誘導)한 후(後), 다시 methionine 영양요구주, lysine 영양요구주, isoleucine 영양요구주, lysine 영양요구주, isoleucine 영양요구주, methionine 및 isoleucine 영양요구주를 선발(選拔)하였다. 또한 선발(選拔)된 영양요구성 변이주들 중에서 L-threonine 생성능(生成能)이 원균(原菌)에 비(比)해 $3{\sim}4$배(倍)정도 우수한 B-13균주(菌株)$(met^-)$를 선발(選拔)하여 L-threonine 생성력(生成力), 배지(培地) 조성(組成) 및 배양(培養)에 따른 몇가지 요인(要因)들에 대하여 실험한 결과 다음과 같은 결과(結果)를 얻었다. 1. L-threonine생성량은 원균주가 1.4mg/ml에 비해 methionine 영양요구성 변이주인 B-13은 4.86mg/ml로서 약 3.5배(倍)의 높은 생성량을 나타내었다. 2. B-13에 의한 L-threonine 생성(生成)에 적당한 배지조성(培地組成)은 glucose 10%, ammonium sulfate 2%, potassium phosphate monobasic 0.2%, magnesium sulfate 0.05%, biotin $200{\mu}g/l$ thiamine $300{\mu}g/l$이였으며 nicotinic acid 0.05% 첨가시 더욱 증가 되었다. 3. B-13에 있어서 유기영양원에 대한 효과는 yeast extract와 Peptone이 양호하였으며 영양요구물질인 metionine은 $100{\mu}g/ml$가 적당하였으며 aspartic acid와 homoserine 첨가시 L-threonine 생성이 증가되었으며 lysine 첨가시에는 감소하는 경향이 나타났다. 4. B-13에 의한 L-threonine 생성에 가장 적절한 pH는 $7.0{\sim}8.0$이였으며 배양일수(培養日數)는 4일(日)이 적당하였다.
L- $\alpha$ -glycerophosphate oxidase(GPO)는 L- $\alpha$-glycero-phosphate를 산화시켜 dihydroxyacetone phosphate와 과산화수소의 생성을 촉매시켜 주는 효소로서 혈중에 존재하는 triglyceride의 양을 측정하는 kit를 개발하는데 이용할 수 있으며 본 연구 결과로 종균을 개발 및 확보하였으며, 이 종균의 사용으로 GPO의 발효공정기술을 확립하였고, 또한 이들 조효소로부터 순수한 효소를 생산할 수 있는 정제공정 기술을 확립하였다. 먼저 ATCC에서 네 가지 균주와 KCTC에서 세 가지 균주, 그리고 본 연구실에서 분리한 Streptococcus faecium $M_{74}$.LC 균주 등 8가지 균주의 성장상태를 비교하고 GPO의 역가를 측정 해 본 결과, 배양액 1 L당 ATCC 19634는 65 units, ATCC 12755는 60 units, S. faecium $M_{74}$. LC는 67 units로 S. faecium $M_{74}$.LC가 제일 높은 역가를 생산하였다. 또한 발효조에서 배지의 양을 3 L로 하여 배양온도는 $37^{\circ}C$, 교반속도는 300 rpm, 통기량은 0.5 L/min, 17시간 배양하였을 때 가장 많은 양의 균체가 생성되었으며, GPO의 생산량도 가장 많았다(256 units/L). 이 때 배지 조성은 glucose 0.1%, glycerol 0.2%, tryptone 1.0%, yeast extract 1.0% 및 $K_2HP0_4$0.5%로 하여 배양하였고 GPO의 정제공정은 염투석 분획과 이온 교환수지 공정으로 대별할 수 있으며, 이온교환수지는 DEAE-cellulose 칼럼을 이용한 정제수율은 약 47%를 얻을수 있었다.
본 연구에서는 하수슬러지의 유기산 생산에 있어 해조류 첨가를 통한 상승효과를 확인하고자 새로운 접근을 시도하였다. 기질농도를 동일하게 20 g COD/L로 하고 하수슬러지와 해조류의 혼합비율을 COD 기준, 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100으로 조절하여 실험하였다. 실험 온도는 $35^{\circ}C$, 중온에서 이루어졌고 메탄 생산균의 활성을 억제하기 위해서 $90^{\circ}C$, 20분간 열처리된 혐기성소화슬러지를 식종균으로 이용하였다. 실험결과를 살펴보면, 해조류의 첨가량이 증가할수록 유기산의 농도도 증가하는 경향을 나타내었으며 혼합비율별 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100 (하수슬러지:해조류) 유기산 생산량은 각각 1.45, 3.22, 4.28, 5.24, 4.82 g COD/L이었다. 하수슬러지와 해조류만의 유기산 생산량을 기반으로 하여 상승효과를 계산한 결과, 혼합비율 75:25, 50:50, 25:75 에서 각각 0.92, 1.14, 1.26 g COD/L로 나타났다. 이는 해조류가 25% 비율로 첨가 시 전체 생산된 유기산의 40%가 상승효과에 의해 생산되었음을 의미하며, 해조류의 상대적인 높은 C/N비와 생분해도에 기인한다.
$30^{\circ}C$에서 에탄올 발효력이 우수한 Saccharomyces carlsbergensis와 $42^{\circ}C$에서 성장력이 우수한 Kluyveromyces maxianus를 원형질체 융합을 통하여 고온에서도 발효력이 우수한 효모 균주를 개발하고자 하였다. 원형질체 융합을 위해 원형질체 형성율의 최적 조건을 조사하였는데, 두 균주 모 두 삼투안정제는 1.2M KCl, 세포벽 분해 효소의 농도와 처리 시간은 각각 200 (unit/ml)와 90분으로 동일하였고, 전처리용액으로서 EDTA와 mercaptoethanol의 농도, 그리고 최적 pH는 두 균주가 차이를 보여 S. carlsbergensis가 각각 10-20 mM/ml, $4.0\mu$l/ml, 그리고 7.0이었고, K. marxianus의 경우 20mM/ml, 2.5-4 $\mu$l/ml, 그리고 8.0이었다. 원형질체 형성을 위한 최적 조건하에서 원형질체 형성을 S. carlsbergensis의 경우 92.94%, K marxianus는 98%였으며, 두 균주의 원형질체 융합율은 $1.4\times10^{-6}-4.8$\times10^{-7}$으로 나타났다. 두 균주를 융합시킨 결과 SG배지$ 30^{\circ}C$에서 6-8일 배양 후에 27주의 융합주들을 획득하였고, 이 중에서$ 42^{\circ}C$에서 성장을 보인 융합주는 6주이었다. $42^{\circ}C$ 그리고 16%(w/v) 포도당이 함유된ㄴ 배지에서 3일 발효 후 모균주들이 3.2-3.4%(w/v)의 에탄올을 생산하였는데 비해 융합주 SK41-4와 SK53-22는 같은 조건에서 모두 5.2%(w/v)의 에탄올을 생산하였다. 고온내성에 대한 안정성을 조사한 결과, SK53-22 경우 세포 분열이 거듭됨에 따라 안정성이 감소하였으나, SK41-4는 30세대 세포분열 후 100.0%로서 안정성이 매우 높았다.
pH가 혐기성 수소 발효에 미치는 영향을 고찰하기 위해 배양기간 동안 pH를 $3\sim10$까지 일정하게 유지시킨 상태에서 수소생산 효율을 살펴보았다. 유입기질을 sucrose로 하여 생성된 가스는 이산화탄소와 수소였으며 메탄가스는 검출되지 않았다. 수정 Gompartz 방정식을 이용하여 수소가스 발생량$(P_h)$과 최대수소 생성율$(R_h)$을 회귀분석하였을 때 pH 5에서 수소가스 발생량$(P_h)$은 약 1182 mL이고 최대수소 생성율$(R_h)$은 112.46 mL/g dry wt biomass/hr이였다. 수소 전환율은 22.56%이였으며 butyrate/acetate 비가 pH 5에서는 1.63, pH 6에서는 0.38로 ratio값이 높은 pH 5에서 효율이 더 좋다는 것을 확인할 수 있었다. Haldane equation을 이용하여 비수소생산율을 산정해 본 결과 최대 비수소생산율은 119.61 mL/g VSS/hr이였고, 최대 비수소생산율을 나타내는 pH는 5.5로 판명되었다.
김치에서 분리한 유산균 Lactobacillus(L.) plantarum 3 균주(strain No.49, No.61, No.75)의 ${\beta}-galactosidase$의 생성을 위한 최적 조건을 검토하고, 효소학적 특성을 조사하였다. 효소 ${\beta}-galactosidase$의 최적 생성 조건은 strain No. 49의 경우 탄소원을 dextrose대신에 lactose를, strain No. 75 균주는 galactose를 1.0% 함유한 MRS broth에서, 초기 pH를 6.5로 하여 $30^{\circ}C$에서 48시간 배양하였을 때로 판명되었다. Strain No. 61 균주의 경우는 lactose를 3.0% 함유한 MRS 배지의 초기 pH를 7.5로 하여 실온에서 48시간 배양하였을때가 최적생성조건이었다. 효소의 최적 활성 온도는 $60^{\circ}C,\;37^{\circ}C,\;50^{\circ}C$로 3균주 모두 L. plantarum임에도 불구하고 각각 다른 온도에서 최고 활성을 보였다. 특히, strain No. 61, No. 75는 반응 온도가 상승함에 따라 활성의 감소가 관찰된 반면 strain No. 49는 $60^{\circ}C$의 높은 온도에서 가장 높은 활성을 보여 높은 온도에서도 효소활성이 유지 되는 점은 주목할 만하였으며, 3균주 모두 $45^{\circ}C$까지 90% 이상의 안정성을 나타내었다. 한편 효소의 최적 pH는 3 균주 모두 pH 6.5이었으며, pH 6.0에서 효소활성이 가장 안정하였다.
복숭아 미이라 과일로부터 복숭아 잿빛무늬병 Monilinia fructicola에 대하여 강한 항균활성을 보이는 방선균 Streptomyces padanus TH04를 분리하였다. TH04 균주의 배양 추출물 1%를 함유한 배지에서의 균사생육 및 포자발아는 시험한 M. fructicola의 strain에 따라 각각 $79.8{\sim}81%$와 $73.9{\sim}75.8%$ 억제되었다. 병원균과 TH04 균주 초기접종 밀도를 0.01%, 0.1% 및 1%로 달리하여 동시배양 한 결과, 항균활성은 선발 방선균의 밀도에 따라 $7.5%{\sim}94%$로 나타났다. 사과(품종; 후지)를 이용한 조추출물의 항균활성은 0.1% 처리구 85.9%, 1%처리구 100%로 나타났다. 항균활성 물질 생산, 안정성 및 제형화에 관한 연구가 이루어질 경우 선발한 Streptomyces padanus TH04는 생물학적 방제제로의 개발 가능성 있을 것으로 생각된다.
본 연구는 식품으로 사용하고 있는 유산균의 보존성과 안정성을 높이고, 맛과 시각적인 차별화를 주기 위한 방법으로 더블매트릭스 캡슐화에 대한 제조방법에 대하여 기술하였다. 일차캡슐화방법으로 5wt%의 슈크로스에스터를 이용하여 부드럽고 촉촉한 크림을 만들었다. 더블매트릭스캡슐화는 키토산과 아르긴산을 1:3의 비율로 혼합하여 제조하였을 때 가장 안정한 캡슐이 형성되었다. 더블매트릭스 캡슐입자의 크기는 지름이 3mm이었다. 유산균의 pH변화에 대한 활성은 산성($pH=4.3{\pm}0.3$)이나 중성($pH=7.12{\pm}0.2$)상태에서보다 알칼리성 ($pH=10.5{\pm}0.3$)에서 더욱 우수한 활성을 보였다. 1개월 경과 후에서도 살아있는 유산균의 활성을 확인할 수 있었다. 식품산업에 응용으로 요거트안에 유산균캡슐이 함유된 제형과 5가지의 색상을 입힌 더블매트릭스캡슐을 개발하였다. 이상의 결과로 볼 때, 유산균을 안정화시키는 방법의 하나의 도구로써, 더블매트릭스캡슐이 식품산업에 크게 기여할 것으로 기대된다. 더 나아가 의약품산업에서 인슐린 등의 캡슐화를 통한 약물전달시스템 (drug delivery system) 및 화장품산업에서의 활성성분의 안정화 기술에 응용이 가능할 것으로 기대한다.
백합구근을 식품으로 활용하기 위한 일환으로 구근을 첨가한 전통민속발효주를 개발하기 위하여 알코올 발효 조건을 검토하고 그의 생리기능성을 조사하였다. 백합구근을 건조분말과 생구근 상태로 첨가량을 달리하여 발효한 결과, 구근건조분말 첨가량이 증가할수록 발효 초기에는 에탄올생성량이 무첨가구보다 낮았으나 발효 후기로 갈수록 에탄올 생성량이 높았으며, $25^{\circ}C$에서 10일간 발효시켰을 때 건조분말 15% 첨가 발효주와 생구근 20% 첨가 발효주의 에탄올함량이 각각 19.4%, 19.0%이었다. 첨가량에 따른 발효주의관능검사 결과 백합구근 건조분말을 5% 또는 생구근 20%정도 첨가하였을 때 색, 향, 맛 및 전체적인 기호도면에서 가장 기호도가 좋았으며, 특히 건조분말을 첨가하였을 때가 생구근 첨가 발효주보다 기호도가 더 높았다. 기호도가 가장 좋았던 건조분말 5% 첨가 발효주와 생구근 20% 첨가 발효주의 생리기능성을 측정한 결과 전자공여능, SOD 유사활성, ACE 저해활성 및 tyrosinase 저해활성이 무첨가구인 대조구보다 우수하였으며, 생구근 첨가 발효주보다 건조분말 첨가 발효주가 생리기능성이 약간 더 높았다.
최근 쌍별귀뚜라미와 갈색거저리, 흰점박이꽃무지 및 장수풍뎅이의 유충이 식품의약품안전처에서 정한 식품공전에 등록되어 일반식품원료로 인정되면서 식용곤충에 대한 관심이 높아짐에 따라 안전한 사육기술의 개발 및 표준화에 관한 연구가 요구되고 있다. 본 조사는 대표적인 식용곤충종인 흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이, 그리고 갈색거저리를 대량사육하는 선도농가에 대한 현장조사 결과로, 흰점박이꽃무지와 장수풍뎅이는 참나무톱밥을 기본 먹이원으로 사용하고 갈색거저리는 밀기울을 기본 먹이원으로 사용하며, 각 곤충별로 추가되는 첨가물의 조성, 발효법, 먹이원의 공급시기, 사육조건, 출하 전까지의 유충 발육기간 등의 전반적인 생육조건들은 농가별로 상이하였다. 단지, 식용곤충별 유충의 무게는 사육밀도가 낮으며 출하 전까지 유충의 사육기간이 긴 경우 가장 무거운 것으로 조사되었다. 또한 식용곤충별로 48시간 절식 후 중금속 함량 분석 결과, 모든 곤충종에 있어 납과 카드뮴, 또는 비소의 함량이 식품의약품안전처에서 제시한 일반식품허용기준 이하의 수준이거나 검출되지 않았다. 따라서 조사 결과들을 바탕으로 흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이, 그리고 갈색거저리의 사육조건과 먹이원, 사육방법 등을 표준화함으로써 양질의 균일한 곤충을 생산하고, 출하 전 48시간 이상의 절식 조건을 준수하여 중금속으로부터 안전성을 확보함으로써 식 약용 소재로의 활용 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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