유제품에 들어 있는 우유와 산양유를 동정하기 위해 미토콘드리아의 12S rRNA 유전자를 목표로 하는 primer을 이용하는 duplex PCR 분석을 적용하였다. 소와 산양의 특이성 primer을 이용한 duplex PCR 분석은 우유와 산양유 DNA에 대해 각각 233 bp와 326 bp의 특이성 단편을 나타냈다. Duplex PCR 분석이 라벨에 표시된 성분을 확인하기위하여 시중마트에서 구입한 15개 유제품에 적용하였다. Duplex PCR 분석 결과 4개 시유, 3개 요구르트, 1개 전지분유는 표시된 성분과 완전히 일치하였다. 그러나 7개의 조제분유 중 5개만 표시성분과 일치하고 2개 조제분유제품은 산양유와 우유가 각각 오염되어 있는 것으로 나타났다. 제안된 duplex PCR 분석은 산양유에 들어있는 우유를 0.1%까지 측정할 수 있는 민감하고 신속한 방법이다. Duplex PCR 분석은 유제품 속에 들어있는 우유와 산양유를 one-step 방법으로 동시에 탐지할 수 있다.
유전자변형 장미 개발에 이용된 형질전환 벡터 pSPB130을 검출할 있는 duplex PCR이 개발되었다. 유전자변형 장미를 검출하기 위해 anthocyanin synthase($ANS$)가 장미 내 재유전자로 PCR 검사법에 이용하였다. 107bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 RHANS-KF/KR primer가 ANS 유전자를 증폭시키는데 이용되었고, 이것을 이용하여 9개의 다른 식물에 대해서 PCR한 결과 장미에서만 특이적인 증폭산물이 확인되었다. GMRH-KF/KR primer가 형질전환 벡터 pSPB130에 삽입된 35S promoter와 flavonoid 3',5'-hydroxylase($F3^{\prime}5^{\prime}H$) 사이의 염기서열을 확인할 수 있도록 제작되었다. 본 연구에서 개발된 duplex PCR의 검정한계치는 약 0.5%이며, 이러한 duplex PCR이 우리나라 미승인 유전자변형 장미를 모니터링 하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
우리나라에서 미승인 품목인 유전자변형 감자 EH92-527-1를 검출하기 위한 duplex PCR 검사법이 개발되었다. 감자의 내재유전자로 UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP)가 선별되었고, 14개 다른 작물을 이용하여 특이성이 확인되었다. 유전자변형 감자에 삽입된 T-DNA 영역과 감자 게놈 사이의 연결 부위를 증폭하도록 프라이머 EH92-F/R 쌍이 제작되었고, 몇 개의 다른 유전자 변형 작물을 이용하여 특이성이 확인되었다. 서론에서 언급한 바와 같이 BASF사에서 각 개발된 유전자변형 감자 EH92-527-1과 BPS-A1020-5가 GBSS 유전자를 동일하게 포함하고 있으나 본 연구에서 개발한 검사법은 event-specific primers를 이용하였기 때문에 유전자변형 감자 EH92-527-1에만 특이성을 나타낸다. 이와 같이 개발된 duplex PCR 검사법의 검정한계치는 약 0.05%이다. 이러한 duplex PCR 검사법이 우리나라에 미승인 유전자변형 감자의 모니터링에 유용하게 사용될 것으로 판단한다.
Kim, Mi-Ju;Lee, Shin-Young;Kim, Hyun-Joong;Lee, Jeong Su;Joo, In Sun;Kwak, Hyo Sun;Kim, Hae-Yeong
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
제26권8호
/
pp.1398-1403
/
2016
The simultaneous detection and accurate identification of hepatitis A virus (HAV) is critical in food safety and epidemiological studies to prevent the spread of HAV outbreaks. Towards this goal, a one-step duplex reverse-transcription (RT)-PCR method was developed targeting the VP1/P2B and VP3/VP1 regions of the HAV genome for the qualitative detection of HAV. An HAV RT-qPCR standard curve was produced for the quantification of HAV RNA. The detection limit of the duplex RT-PCR method was 2.8 × 101 copies of HAV. The PCR products enabled HAV genotyping analysis through DNA sequencing, which can be applied for epidemiological investigations. The ability of this duplex RT-PCR method to detect HAV was evaluated with HAV-spiked samples of fresh lettuce, frozen strawberries, and oysters. The limit of detection of the one-step duplex RT-PCR for each food model was 9.4 × 102 copies/20 g fresh lettuce, 9.7 × 103 copies/20 g frozen strawberries, and 4.1 × 103 copies/1.5 g oysters. Use of a one-step duplex RT-PCR method has advantages such as shorter time, decreased cost, and decreased labor owing to the single amplification reaction instead of four amplifications necessary for nested RT-PCR.
두 가지 primer 쌍을 동시에 이용한 duplex PCR 기법으로 붉은사슴과 엘크의 유전자 성 판별에 대한 이용가능성을 확인하기 위해 본 연구를 수행하였다. 근본적으로 포유동물의 성 분화는 Y-염색체 상에 암호화되어 있으며 웅성발생에 지배적인 역할을 수행하는 SRY 유전자의 존재 여부에 따라 결정되게 된다. X-, Y- 염색체에 상동인 유전자들 중 하나인 ZFX-ZFY 유전자는 X-, Y- 염색체 상에서 각각 발견된다. 유전자 성 판별에 앞서 붉은사슴의 ZFX-ZFY 유전자의 인트론 9를 포함하는 절편에 대한 염기서열의 특성을 확인하였다. 인트론 9의 길이는 ZFX와 ZFY에서 각각 529, 665-bp로 확인되었다. ZFY 인트론 9에서 전위인자의 일종인 bovine SINE element와 유사한 서열이 관찰되었다. SRY와 ZFX-ZFY 유전자들을 동시에 증폭하는 duplex PCR을 통해 유전자 성 판별을 수행하였고, 암수가 서로 구분되는 증폭 양상을 나타내었다: 암컷에서는 ZFX에서 증폭된 공통의 증폭 산물 하나만이 관찰되었고 수컷은 세 개의 밴드가 관찰되었다(ZFX에 해당하는 공통의 밴드와 ZFY와 SRY에서 증폭된 두 개의 수컷 특이 밴드). 두 가지 유전자에 대한 독립적인 PCR 시험에서 얻은 결과는 duplex PCR에 의해 얻은 결과와 동일한 양상을 나타내었다. 또한 유전자 성 판별의 결과들은 각각의 개체에 대한 표현형적 성판별 자료와 정확히 일치하였다. Y 염색체 특이적인 SRY와 X-, Y- 상동이면서 성적 이형성을 나타내는 ZFX-ZFY 유전자들에 대한 duplex PCR 방법은 붉은사슴과 엘크의 성 판별에 있어 여타 다른 대조시험을 요구하지 않으면서 없이 신속하고 정확한 정보를 제공하는 분석법이 될 것으로 기대된다.
국제 무역 및 전세계 수산물 소비의 증가로 인해 다양한 수산물이 국내로 수입되어 유통되고 있다. 최근 수입 수산물의 종명 및 원산지 표시사항을 허위로 기재하는 경우가 급증하여 식품안전성에 심각한 문제가 야기되고 있다. 불법적으로 유통되는 수산물의 안전관리를 위해 DNA 기반 기술을 이용한 종 판별법 마련이 시급하다. 본 연구에서는 전세계적으로 중요한 대형선망어업 어종 중 하나인 전갱이속 어류의 종을 판별하기 위해 duplex-PCR을 사용한 검출 방법을 개발하였다. 국내에 유통되는 T. japonicus과 T. novaezelandiae의 시료를 확보하여 COI 영역의 염기서열 분석을 통하여 종간 특이성을 나타내는 단일염기다형성 유전자를 탐색하였으며, PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 2개의 종 특이적인 정방향 primer를 설계하였다. Duplex-PCR 분석 결과, T. japonicus (103 bp), T. novaezelandiae (214 bp)와 같은 단일 밴드를 전기영동상에서 확인 할 수 있었으며 상호간의 비 특이적 밴드는 형성되지 않았다. 또한 duplex-PCR 방법을 통한 T. japonicus과 T. novaezelandiae에서 최저 $0.01ng/{\mu}l$까지 검출됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 duplex-PCR 분석법을 이용한 전갱이속 어류의 종 판별법은 정확도와 민감도가 우수하여 수산물의 수출입 및 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 수산물안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
In the present work, a pair of primers specific to Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) was designed to allow specific amplification of DNA fragments from any TYLCV isolates using an extensive alignment of the complete genome sequences of TYLCV isolates deposited in the GenBank database. A pair of primers which allows the specific amplification of tomato ${\beta}$-tubulin gene was also analyzed as an internal PCR control. A duplex PCR method with the developed primer sets showed that TYLCV could be directly detected from the leaf crude sap of infected tomato plants. In addition, our developed duplex PCR method could determine PCR errors for TYLCV diagnosis, suggesting that this duplex PCR method with the primer sets is a good tool for specific and sensitive TYLCV diagnosis. The developed duplex PCR method was further verified from tomato samples collected from some farms in Korea, suggesting that this developed PCR method is a simple and reliable tool for rapid and large-scale TYLCV detections in tomato plants.
Phytophthora katsurae는 밤나무 잉크병의 원인이 되는 병원성 균류이다. P. katsurae를 검출하기 위하여 2개의 duplex PCR primer set을 제작하였다(SOPC 1F/1R+KatI 3F/5R, SOPC 1-1F/1-1R+KatI 3F/5R). SOPC 1F/1R과 SOPC 1-1F/1-1R primer pair는 sequence characteristic amplification regions(SCAR)를 이용하여 제작하였고, KatI 3F/5R primer pair는 internal transcribed spacer(ITS) 부위로부터 제작하였다. 추출한 genomic DNA를 1 mg/ml에서 1 ng/ml까지 10배씩 순차적으로 희석하여 균사량에 따른 Duplex PCR의 민감도를 확인한 결과, 2개의 primer set은 각각 1 ${\mu}g/ml$와 100 ng/ml까지 검출이 가능하였다. 유주포자를 $1{\times}10^6$부터 $1{\times}10^2$ cells/ml까지 10배씩 순차적으로 희석하고 genomic DNA를 추출하여 P. katsurae의 유주포자량에 의한 검출 한계를 확인한 결과, 2개의 primer set 모두 $1{\times}10^5$ cells/ml까지 검출할 수 있었다. 각각의 primer set은 PCR 검출을 실시하였을 때 P. katsurae 균주에서만 PCR 산물이 증폭된 반면에, Phytophthora 16종에서는 P. katsurae에 특이적인 PCR 증폭산물이 생성되지 않았다. 따라서, 2개의 primer set을 이용한 Duplex PCR은 P. katsurae의 신속하고 효과적인 검출에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
본 연구에서는 신선편의 채소와 과일에서 주로 검출되는 대장균(E. coli Ol577:H7), 리스테리아(L. monocytogenes), 살모넬라(Salmonella, spp.), 형색포도상구균(S. aureus)을 검출하고 동정할 수 있는 real time PCR 방법을 melting curve 분석을 활용하여 single tube 반응으로 두 종의 식중독균을 동시 검출하는 방법을 개발하고자 하였다. 대장균의 ${\beta}$-glucuronidase (uidA), 황색포도상구균의 thermonuclease (nuc), 리스테리아의 hemolycin (hly), 살모넬라의 tetrahionate reductase (ttr) 를 특이적으로 검출할 수 있는 4종의 프라이머 세트에 대한 real-time PCR의 melting curve 분석을 통하여 황색포도상구균과 대장균 동시분석 시 $T_m$ 값이 $80.6{\pm}0.9^{\circ}C$와 $86.9{\pm}0.5^{\circ}C$, 리스테리아와 살모넬라 동시분석 시 Tm 값이 $80.4{\pm}0.6^{\circ}C$와 $88.1{\pm}0.11^{\circ}C$로 확인하였고, 그 결과 정제되어진 각 식중독균의 genomic DNA를 주형으로 한 duplex real-time PCR 방법이 uniplex real-time PCR 방법과 마찬가지로 10 genome equivalents 까지 검출할 수 있는 민감도를 나타내었다. 또한, 양배추에 네 종의 식중독균을 접종하고, 증균배양 없이 DNA를 추출하여 duplex real-time PCR 을 수행한 결과 모든 식종목균에서 $10^3$ CFU/g의 검출 한계를 나타내었다. 결과적으로 개발된 melting curve 분석을 이용한 duplex real-time PCR 방법은 식품안전 증진을 위한 시간, 노동력, 비용 절감에 있어서 유효한 방법이 될 것으로 판단된다.
반추수에서 발생하는 Johne병의 조기 진단 방법을 제시하고 이 질병의 원인체와 미생물학적 특징 이 유사한 M. bovis, M. avium 등의 mycobacteria 감염증을 감별 진단하는 방법 을 개발하기 위하여 Mycobacterium 균속의 표준균주를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 확립하였다. Johne병으로 의심되는 소의 혈액과 유즙을 채취하여 분리한 단핵구 및 거식세포로부터 genomic DNA를 추출하였다. 각 시료로부터 추출한 DNA를 template로 이용하여 Mycobacterium spp.에 특이적인 16S rDNA primer set를 이용한 PCR을 수행하여 시료내의 mycobacterial DNA 보유 여부를 확인하였다. 한편 mycobacteria 양성으로 확인된 시료는 M. avium complex 균종에 특이한 16S rDNA 염기서열을 기초로 하여 제작한 primer set와 M. paratuberculosis의 IS900 sequence에 특이한 primer set를 이용하여 duplex PCR을 수행하여 Johne병 원인체의 보균 여부를 조사하였으며, 이 결과를 oligonucleotide probe를 사용한 Southern blot hybridization을 통하여 다시 확인하였다. 이와 같은 duplex PCR기법을 실제 축산 현장에서 수집한 유즙과 말초혈액으로부터 분리한 단핵구 및 거식세포 시료에 적용한 결과 본 연구에서 확립한 duplex PCR기법 유용성을 확인할 수 있었다.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.