• 한국진공학회:학술대회논문집
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• 한국진공학회 2013년도 제44회 동계 정기학술대회 초록집
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• pp.108-109
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• 2013

Mitochondria play key roles in the production of cell's energy. Their dominant function is the synthesis of adenosine 5'-triphosphate (ATP) from adenosine diphosphate (ADP) and phosphate (Pi) through the oxidative phosphorylation. Evaluation of drug-induced mitochondrial toxicity has become increasingly important since mitochondrial dysfunction has recently been implicated in numerous diseases including cancer and diabetes mellitus. Mitochondrial functions have been monitored via oxygen consumption, mitochondrial membrane potential, and more importantly via ATP synthesis since ATP synthesis is the most essential function of mitochondria. Various analytical methods have been employed to investigate ATP synthesis in mitochondria, including high performance liquid chromatography (HPLC), bioluminescence technique, and pH measurement. However, most of these methods are based on destructive analysis or indirect monitoring through the enzymatic reaction. Infrared absorption spectroscopy (IRAS) is one of the useful techniques for real-time, label-free, and direct monitoring of biological reactions [1,2]. However, the strong water absorption requires very short path length in the order of several micrometers. Transmission measurements with thin path length are not suitable for mitochondrial assays because solution handlings necessary for evaluating mitochondrial toxicity, such as rapid mixing of drugs and oxygen supply, are difficult in such a narrow space. On the other hand, IRAS in the multiple internal reflection (MIR) geometry provides an ideal optical configuration to combine solution handling and aqueous-phase measurement. We have recently reportedon a real-time monitoring of drug-induced necrotic and apoptotic cell death using MIR-IRAS [3,4]. Clear discrimination between viable and damaged cells has been demonstrated, showing a promise as a label-free and real-time detection for cell-based assays. In the present study, we have applied our MIR-IRAS system to mitochondria-based assays by monitoring ATP synthesis in isolated mitochondria from rat livers. Mitochondrial ATP synthesis and hydrolysis were in situ monitored with MIR-IRAS, while dissolved oxygen level and solution pH were simultaneously monitored with O2 and pH electrodes, respectively. It is demonstrated that ATP synthesis and hydrolysis can be monitored by the IR spectral changes in phosphate groups in adenine nucleotides and MIR-IRAS is useful for evaluating time-dependent drug effects of mitochondrial toxicants.

• Molecules and Cells
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• 제43권3호
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• pp.276-285
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• 2020

Circadian rhythm is an endogenous oscillation of about 24-h period in many physiological processes and behaviors. This daily oscillation is maintained by the molecular clock machinery with transcriptional-translational feedback loops mediated by clock genes including Period2 (Per2) and Bmal1. Recently, it was revealed that gut microbiome exerts a significant impact on the circadian physiology and behavior of its host; however, the mechanism through which it regulates the molecular clock has remained elusive. 3-(4-hydroxyphenyl)propionic acid (4-OH-PPA) and 3-phenylpropionic acid (PPA) are major metabolites exclusively produced by Clostridium sporogenes and may function as unique chemical messengers communicating with its host. In the present study, we examined if two C. sporogenes-derived metabolites can modulate the oscillation of mammalian molecular clock. Interestingly, 4-OH-PPA and PPA increased the amplitude of both PER2 and Bmal1 oscillation in a dose-dependent manner following their administration immediately after the nadir or the peak of their rhythm. The phase of PER2 oscillation responded differently depending on the mode of administration of the metabolites. In addition, using an organotypic slice culture ex vivo, treatment with 4-OH-PPA increased the amplitude and lengthened the period of PER2 oscillation in the suprachiasmatic nucleus and other tissues. In summary, two C. sporogenes-derived metabolites are involved in the regulation of circadian oscillation of Per2 and Bmal1 clock genes in the host's peripheral and central clock machineries.

• 미생물학회지
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• 제45권4호
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• pp.419-424
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• 2009

발광 세균 Photobacterium과 Vibrio의 lux 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 유전자 전이시킨 발광표현형 대장균이 내는 빛의 세기를 조사하였다. 여러 대장균 균주에 형질전환 시켰는 바, 빛을 내는데 관여하는 효소들을 코드하는 유전자를 모두 포함하는 Photobacterium leiognathi lux 오페론이 삽입된 재조합플라스미드(PlXba.pT7-3)가 형질전환된 대장균 43R (Escherichia coli 43R) 균주에서는 발광세기가 다른 균주에 비해 1,000배 이상 되었으며, Vibrio harveyi luxA 유전자와 luxB 유전자를 융합시킨 유전자가 삽입된 재조합플라스미드(VhluxAB.pT7-5)가 형질전환 된 대장균 43R (E. coli 43R)에서는 기질인 fatty aldehyde를 가하면 단일 콜로니에서도 빛을 볼 수 있게 되는 대장균 형질전환체를 얻었다. 또한 이들이 중금속에 노출되었을 때 생물발광이 감소하였으며, 이들 발광 대장균 형질 전환체가 담긴 고정화된 세포에서도 빛을 내는 것을 관측함으로써 이들 실험 결과들이 lux 유전자를 활용한 바이오센서 시스템 개발의 기반 기술이 될 가능성을 보였다.

• Laboraroty Animal Research
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• 제34권4호
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• pp.248-256
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• 2018

O-2-$^{18}F$-fluoroethyl-l-tyrosine ($[^{18}F]FET$) has been widely used for glioblastomas (GBM) in clinical practice, although evaluation of its applicability in non-clinical research is still lacking. The objective of this study was to examine the value of $[^{18}F]FET$ for treatment evaluation and prognosis prediction of anti-angiogenic drug in an orthotopic mouse model of GBM. Human U87MG cells were implanted into nude mice and then bevacizumab, a representative anti-angiogenic drug, was administered. We monitored the effect of anti-angiogenic agents using multiple imaging modalities, including bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI), and positron emission tomography-computed tomography (PET/CT). Among these imaging methods analyzed, only $[^{18}F]FET$ uptake showed a statistically significant decrease in the treatment group compared to the control group (P=0.02 and P=0.03 at 5 and 20 mg/kg, respectively). This indicates that $[^{18}F]FET$ PET is a sensitive method to monitor the response of GBM bearing mice to anti-angiogenic drug. Moreover, $[^{18}F]FET$ uptake was confirmed to be a significant parameter for predicting the prognosis of anti-angiogenic drug (P=0.041 and P=0.007, on Days 7 and 12, respectively, on Pearson's correlation; P=0.048 and P=0.030, on Days 7 and 12, respectively, on Cox regression analysis). However, results of BLI or MRI were not significantly associated with survival time. In conclusion, this study suggests that $[^{18}F]FET$ PET imaging is a pertinent imaging modality for sensitive monitoring and accurate prediction of treatment response to anti-angiogenic agents in an orthotopic model of GBM.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제34권3호
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• pp.277-282
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• 2019

본 연구에서는 한국 전통 식품에서 Salmonella Typhimurium와 Listeria monocytogenes의 검출에 대하여 LAMP에 기반한 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2)와 식품공전에 등재된 분리배지, real-time PCR의 검출 성능을 비교하고자 하였다. 육회와 육사시미에 $10^0-10^4CFU/25g$의 수준으로 S. Typhimurium와 L. monocytogenes을 각각 접종하였다. Citrobacter freundii와 Listeria innocua는 S. Typhimurium와 L. monocytogene의 검출에 영향을 주는 균으로 사용하였다. S. Typhimurium와 L. monocytogenes만 $10^0-10^4CFU/25g$ 수준으로 접종한 모든 시료에서는 분리배지, real-time PCR과 LAMP에서 양성으로 검출되었다. C. freundii와 L. innocua를 같이 접종한 경우에서 부분적으로 양성이 나타났다. 육회와 육사시미에 대하여 real-time PCR 보다 3M MDA 2가 더 검출효율이 높음을 알 수 있었다. 분리배지가 가장 검출효율이 높았지만 3M MDA 2와 큰 차이가 없었다. 배지를 사용하는 방법은 최소 일주일의 시간이 소요되고 PCR의 경우 inhibitor의 영향을 많이 받아 정확한 검출이 어려운 점이 있다. 그러나 LAMP에 기반한 3M MDA 2는 enrichment 후 다음 날 간단한 protocol을 통해 25분 이내로 샘플의 양성 반응을 확인할 수 있어 식중독균에 대해 신속하고 정확한 검출이 가능한 것으로 판단되었다.

• 미생물학회지
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• 제34권3호
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• pp.154-161
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• 1998

자연미생물, KP964에 luxAB 유전자를 주입하여 발광기능을 부여함으로써 그들의 발광정도가 스트레스에 대한 적응, 생존 및 활성도를 나타내는 색인이 될 수 있는가, 그리고 특히 non-culturable but viable(NCBV) 상태로 존재하는 미생물의 활성에 대한 정보를 제공할 수 있는가를 알아보았다. 영양결핍조건 하에서 그들의 총 세균수, 배양가능세균(colony-forming-unit; CFU)수, viable cell 수, 그리고 발광정도(relative light unit; RLU)의 변화를 조사하였다. 형광현미경으로 확인된 총 수는 변화가 없었으며, 첨가된 yeast extract에 의해 성장하는 viable cell 수는 완만하게 감소하였으나 CFU 수는 급격히 줄어들어 37일 째 이후에는 탐지한계 이하로 감소하였다. RLU의 경우, 처음 7일의 영양결핍동안 0.016%까지 감소하였으며, 그 이후에는 탐지한계수준 이하로 검출되었다. 아울러 스트레스를 받는 4시간 동안 CFU수와 RLU의 관계를 알아보기 위하여 발광 KP964 균주에게 독성유해물질, acid shock, osmotic shocks를 접촉시킨 후 시간별로 CFU와 RLU를 측정한 결과, KP964 CFU 당 RLU는 9.1-26% 까지 감소하였다. 이는 스트레스의 종류에 따라 접촉시간이 길수록 CFU 당 나오는 빛의 양이 줄어듬을 보인 것이다. 이러한 결과는 영양결핍조건 시 RLU의 감소율이 CFU의 감소율보다 더 크며 영양결핍 이외의 다른 스트레스 조건 하에서도 RLU의 감소율과 CFU의 감소율의 연관성을 찾을 수 없음을 보이므로, 발하는 빛의 정량만으로는 NCBV 상태는 물론 배양가능한 세균의 양이나 활성을 나타내지 못하는 듯 하였다. 그러나 스트레스를 받은 KP964의 활성 정도와 잠재발광능력과의 관계는 좋은 연관성을 보여주었다. 즉, p-xylene, hypo-osmotic stress, 또는 영양결핍에 노출된 세균으로부터 각 스트레스를 제거하였을 시 나타나는 발광증가 유형을 조사하였는데, 증가가 시작하기까지의 lag period는 각각 32, 26, 22분으로 나타났다. 즉 미생물에 강력한 스트레스로 작용한 경우일수록 lag time이 길고, 또한 발광의 증가율이 느리며 도달하는 최대 RLU값도 낮음이 관찰되었다. 따라서 스트레스 하의 세균으로부터 직접적인 RLU의 측정보다는 이들이 스트레스 조건으로부터 재성장 또는 소생되는 과정에서의 잠재 발광능력의 분석이 자연세균의 적응, 활성 및 생존의 정도를 나타내주었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제37권3호
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• pp.248-257
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• 2009

Vibrio harveyi 쿼럼 센싱 (quorum sensing; QS) 신호전달에 대한 저해제들이 주 신호물질인 N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone(3-OH-$C_4$-HSL)의 분자 구조를 변형함에 의해 개발되었다. 일련의 구조 변형체들인 N-(3-hyoxysulfonyl)-L-homoserine lactones(HSHLs)들은 고체상 유기합성법 (solid-phase organic synthesis method)으로 합성되었다. 이 물질들의 생체내 쿼럼 센싱 저해능이 V. harveyi 발광을 이용한 bloassay를 system에 의해 측정되었을 때, 모두 의미있는 저해효과를 보여주었다. 이 물질들과 3-OH-$C_4$-HSL 수용체 단백질인 LuxN 사이의 상호작용을 분석하기 위하여 LuxN의 신호 결합 부위를 다른 acyl-HSL 결합 단백질들과의 유사성에 기초하여 시험적으로 결정하였다. 이 추정 신호결합 부위의 부분적 삼차구조를 ORCHESTRA program을 이용하여 예측하였으며, 이 부위 내에서 3-OH-$C_4$-HSL와 HSHLs의 결합 형태와 에너지를 계산하였다. 이렇게 모델링을 통해 얻어진 결과와 생체 내 bioassay를 통해 얻어진 결과의 비교를 통해, 수용체 단백질과 그 리간드 사이의 상호 작용에 관한 in silica 해석이 특히 단백질의 삼차 구조에 대한 정보가 제한적인 경우에 보다 나은 저해제 개발을 위한 유용한 방법이 될 수 있음을 제안한다.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제42권5호
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• pp.383-393
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• 2008

목적: 조직 특이 프로모터를 이용하면 특정 암조직내에서만 원하는 치료유전자를 발현시킬 수 있다. 나트륨 옥소 공동 수송체(sodium iodide symporter: NIS) 유전자는 옥소를 섭취하는 특성을 가져 방사성옥소를 이용한 치료용 유전자로 사용될 수 있다. 광학 영상용 유전자인 luciferase (Luc) 유전자를 세포에 이입하면 비침습적으로 유전자가 이입된 세포의 상태를 평가할 수 있다. 본 연구는 간암 특이성을 나타내는 AFP 프로모터에 의해 발현이 조절되는 NIS유전자와 CMV프로모터에 의해 발현되는 Luc유전자를 간암세포에 이입하여 NIS유전자 이입에 의한 방사성옥소 유전자치료의 효과를 알아보고, 종양사멸 정도를 광학 리포터 유전자 발현으로 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: AFP enhancer와 GSTP 프로모터를 연결하여 AFP프로모터를 제작하였으며 이를 NIS유전자와 연결하였다. 또한 CMV 프로모터에 조절 받는 Luc 유전자를 동시에 삽입하여 AFP-NIS-CMV-Luc 유전자 발현 벡터를 생산하였다. 실험 대상 세포주로는 간암세포주인 HepG2와 Huh-7 세포와 사람 대장암세포주인 HCT-15 세포를 이용하였다. AFP-NIS-CMV-Luc 발현벡터를 Liposome을 이용해 실험대상 세포주 내로 이입하였으며, 방사성옥소 섭취율과 방사성옥소의 유출량을 측정하였다. 또한 Luciferase 발현 정도를 luminometer로 측정하였으며, clonogenic assay를 통하여 I-131에 대한 세포주에 따른 사멸효과 차이를 알아보았다. AFP-NIS-CMV-Luc 유전자 이입 세포주를 누드마우스에 대퇴부 피하에 주입하여 I-131 축적여부를 감마카메라 영상을 획득하였다. 결과: AFP-NIS-CMV-Luc 유전자 발현 벡터를 제작하였다. AFP-NIS-CMV-Luc 유전자가 이입된 HepG2와 Huh-7 세포의 방사성옥소 섭취율은 유전자 이입이 되지 않은 대조군 HepG2와 Huh-7 세포에 비하여 높았으며, $KClO_4$를 처리시 옥소 섭취가 저해되었다. 대장암 세포주인 HCT-15세포에 AFP-NIS-CMV-Luc유전자를 이입 시 방사성옥소의 섭취률은 증가되지 않았다. 30분간 방사성옥소를 섭취시킨 AFP-NIS-Luc 유전자가 이입된 HepG2와 Huh-7 세포에서의 방사성옥소의 유출반감기는 약 4분과 6분으로 각각 나타났다. AFP-NIS-CMV-Luc 유전자가 이입된 HepG2, Huh-7세포의 Luc 유전자의 발현은 241, 441 $RLU/2\;{\times}\;10^5$ cells로 나타났으며, 대조군 HepG2와 Huh구세포에서의 Luc 유전자의 발현은 74, $RLU/2\;{\times}\;10^5$ cells로 나타났다. HCT-15 세포는 AFP-NIS-CMV-Luc 유전자 이입에 따라 I-131에 의한 세포 사멸능이 증가되지 않았으나, HepG2 및 Huh-7 세포는 FP-NIS-CMV-Luc 유전자 이 입에 따라 I-131에 의한 세포 사멸능이 증가되었으며, Huh-7세포의 경우 0.5mCi의 I-131을 투여한 경우 모든 세포가 사멸하였다. AFP-NIS-CMV-Luc 유전자가 이입된 Huh-7 세포수가 많을수록 방사성옥소 섭취율이 증가하며 luciferase활성도도 높게 나타났다. AFP-NIS-CMV-Luc 유전자가 이입된 Huh-7 세포를 이식한 누드마우스에 I-131 감마카메라 영상에서 종양이식부위에 방사능 축적을 관찰 할 수 있었다. 결론: AFP프로모터의 의하여 NIS유전자가 발현되며, CMV프로모터에 의한 Luc 유전자가 발현되는 벡터를 제작하였으며, 이 벡터를 이입한 경우 간암세포에서만 I-131의 세포 독성이 증가하는 효과를 나타내었다. 또한 Luc유전자를 이용하여 비침습적인 광학 영상으로 세포사멸 효과를 확인할 수 있었다. 간암특이 프로모터에 조절되는 치료 유전자와 광학리포터 유전자를 한 벡터에 동시에 이입하면 간암 특이 유전자 치료와 그 치료효과를 비침습적으로 평가할 수 있을 것으로 생각된다.