본 연구의 목적은 한국의 전통 발효 식품인 김치로부터 분리된 4개의 잠재적인 프로바이오틱스 균주의 안전성과 기능적 특성을 측정하기 위한 것이다. 담즙산염에 대한 높은 내성과 내산성 그리고 소수성 특성에 기초하여 한 균주의 Lactobacillus arizonensis (BCNU 9032)와 3 균주의 L. brevis (BCNU 9037, BCNU 9098 and BCNU 9101)는 선택되었다. 모든 균주는 pH 2.5에서 3시간 후에도 99% 이상 생존가능했고, 1%의 담즙산염에 내성을 보였다. 이들 균주는 특히 Echerichia coli와 Shigella sonnei 같은 다수의 식중독 원인균에 대해 우수한 항균활성을 보였다. L. arizonensis BCNU 9032와 L. brevis 9037의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 능력은 시험관내 담즙염 가수분해 활성과 콜레스테롤 동화작용 시험을 통해 검증되었다. 게다가, L. brevis BCNU 9098과 BCNU 9101은 Caco-2 cells에 대해(각각 12.76, 11.86%) 상업균주인 Lactobacillus rhamnosus GG 보다 높은 부착능을 가진 것으로 확인되었다. 이러한 결과들을 이들 균주를 프로바이오틱스로서 사용할 수 있음을 제시하고 있다.
산업폐수로부터 분리한 Pseudomonas sp. BCNU 106은 다양한 유기용매를 이용하여 인돌로부터 인디고를 합성할 수 있다. BCNU 106은 높은 수준의 인돌과 다량의 p-xylene, propylbenzene 그리고 mesitylene의 존재 하에서 효과적으로 인디고를 생산했다. 본 연구에서 인디고의 최대수율 조건은 20% (v/w)의 p-xylene과 4 g/l의 인돌인 것으로 확인되었다. 이러한 조건에서 인디고의 수율과 인돌의 전환효율은 각각 315.5 mg/l와 97%로 조사되었다. 그 결과 Pseudomonas sp. BCNU 106은 산업적으로 중요한 인디고 생산을 위한 잠재적인 균주가 될 것으로 판단된다.
본 연구팀은 태백산 지역에서 토양 시료들을 채취하여 다양한 균주들을 분리 탐색하는 과정에서 BCNU 2001 균주를 분리하였다. 분리균주의 생화학적 특징과 16S 리보좀 RNA 유전자 염기서열 분석 결과, 분리균주가 Pseudomonas aeruginosa에 속함이 확인되었다. 분리균주 BCNU 2001의 상등액은 다양한 세균과 진균에 대해 항균활성이 있었으며 특히 분리균주 BCNU 2001는 Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, 그리고 Aspergillus niger의 생육을 크게 저해할 수 있었으며, Micrococcus luteus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, 그리고 Aspergillus niger에 대하여 각각 18.5mm, 19.0mm, 17.0mm 그리고 13.5mm 크기의 저해환을 나타내었다. 분리균주 BCNU 2001의 핵산 분획물과 디클로로메탄 분획물은 세균에 대해 높은 항균력을 보였으며 디클로로메탄 분획물과 에틸아세테이트 분획물은 진균에 대해 높은 항균력을 보였다. 또한 Pseudomonas sp. BCNU 2001 균주는 그람양성 세균, 그람음성 세균 그리고 진균을 포함한 다양한 미생물들에 대하여 항균력이 있는 항균 펩타이드를 가지고 있음이 확인되었다. 실험을 통하여 얻은 결과는 Pseudomonas sp. BCNU 2001 균주의 유용성에 대한 예비적인 기초를 제공한다.
분리된 toluene내성세균 Pseudomonas sp. BCNU 154을 생물분해반응에 적용하고저 그 가능성을 조사하였다. 방향 족화합물 16개을 대상으로 저화능을 조사한 결과 cumene, cyclohexane, ethylbenzene, p-xylen, m-xylen, toluene 그리고 diphenylether가 공시균쥬에 의해 자화됨이 확인 되었다. Pseudomonas sp. BCNU 154는 toluene, ethylbenzene 그리고 p-xylen 그리고 cumene을 호기적으로 분해하였다. Touene은 12시간후에 완전히 분해되었고, p-xylene과 cumene은 12시간배양시 90% 분해되었으며, ethylbenzene은 12시간 배양시 75%가 분해되었다.
Indole은 미생물에 강한 독성을 가지고 있으므로 indole의 생물학적 전환이 어려우므로 단지 소수의 미생물들이 Indole이나 그것의 연관물질들로부터 Indigo와 Indirubin을 생산하는데 응용되어 왔다. 본 연구실에서 분리된 Pseudomonas savastanoi BCNU 106은 toluene에 강한 내성을 가졌으며 P. savastanoi BCNU 106의 Indole 내성 정도는 p-xylene이나 toluene이 배지 부피의 20% 로 첨가되었을 때 160 mg/ml로 매우 높은 내성 정도를 나타내었다. Indole (100 mg/ml) 과 p-xylene (0.2 ml/ml)을 포함한 two-phase culture system에서 자란 P. savastanoi BCNU 106은 indole로부터 푸른색 indigo나 보라색 indirubin의 미생물학적 전환을 보여주었다. indigo와 indirubin의 생산은 P. savastanoi BCNU 106가 적절한 농도의 유기용매가 중층된 two-phase system에서 자랐을 경우에만 형성되었다. 그러므로 본 연구는, 분리된 indole 내성 세균이 유기용매하에서 indirubin과 같은 산업적 가치를 가진 유용물질을 생산하는데 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
유기용매 내성 세균 Pseudomonas sp. BCNU 106으로부터 생산된 리파아제 조효소액은 pH 4-10의 넓은 범위의 pH와 37℃에서 매우 안정적이었다. BCNU 106의 리파아제 안정성은 25% xylene, hexane, octane, toluene, chloroform 및 dodecane에서 증가하였으며, 상업적인 고정화 효소와 비교해도 우수한 안정성을 보이고 있다. 그리고 Cu2+, Hg2+, Zn2+ 및 Mn2+ 존재 하에서 110% 이상의 상대활성을 나타낸 반면에, Fe2+에서는 효소활성이 억제되었다. 게다가 계면활성제인 tween 80과 triton X-100 및 SDS에서도 높은 안정성을 유지됨이 확인되었다. 본 연구에서 유기용매 내성 Pseudomonas sp. BCNU 106의 리파아제는 고정화 효소에 못지않은 효소 활성 및 안정성을 유지함이 밝혀져 다양한 산업공정에서 잠재적인 생물촉매로 적용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
산업공단지역의 폐수에서 분리한 유기용매 내성 Pseudomonas sp. BCNU 154 리파아제의 최적조건은 $37^{\circ}C$, pH8로 조사되었다. BCNU 154의 crude 리파아제는 toluene에서 2시간 반응시 효소활성 약 6.01 U/ml (117.53%)로 가장 안정한 것으로 나타났다. 한편 $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$, $NH_4{^+}$, $Na^+$ 이온 및 triton X-100은 효소를 활성화시킨 반면에 $Ba^{2+}$, $Hg^{2+}$ 및 $Zn^{2+}$ 이온은 효소활성을 억제하였다. Pseudomonas sp. BCNU 154 리파아제는 상용 고정화 효소인 Novozym 435와 비교해서도 안정한 활성을 보였다. 그러므로 유기용매 내성 리파아제는 별도의 고정화 처리없이도 화학산업공정에서 가능성 있는 whole cell 생물촉매로서 유용할 것으로 판단된다.
In the screening process of organic solvent tolerant bacteria showing good growth in media containing several kinds of organic solvents, one strain was isolated and identified as Bacillus sp. BCNU 5006. The strain was able to tolerate many organic solvents including benzene, toluene, xylene, octane, dodecane, butanol and ethylbenzene. Likewise, it could also utilize these solvents as the sole source of carbon with significant enzyme production. The lipolytic enzyme stability of Bacillus sp. BCNU 5006 was studied in the presence of several kinds of solvents at a 25% (v/v) concentration. The highest enzyme stability was observed in the presence of octane (107%), followed by ethylbenzene (88%), decane (86%), and chloroform (85%). Especially, BCNU 5006 lipase was determined to be more stable than immobilized enzyme (Novozyme 435) in the presence of octane, chloroform and xylene. This organic solvent tolerant Bacillus sp. BCNU 5006 could be expected as a potential bioremediation agent and biocatalyst for biodegradation and provide on organic-solvent-based enzymatic synthetic method in industrial chemical processes.
항생제 및 항진균제 개발에 있어 미생물 유래 천연 생리활성물질 분리를 통한 선도물질을 확보하는 일은 매우 중요하며, 신규 물질을 확보하기 위해 꾸준한 연구가 필요할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구에서는 천연 항생물질의 개발을 위한 연구의 일환으로 태백산 일대의 토양에서, 인체에 다양한 감염증을 유발하는 효모와 곰팡이에 대하여 강한 항진균 활성을 나타내는 BCNU 2003 균주를 분리하여 항진균 활성 물질의 이용가능성에 대해 연구하였다. BCNU 2003은 계통적으로는 B. amyloliquefaciens와 B. vallismortis의 subcluster에 속하는 균주로 동정되어 Bacillus sp. BCNU 2003으로 명명하였다. 항균물질 분리를 위해 ethyl acetate (EA) 추출물과 펩타이드 추출물로 나누어 그람양성 세균, 그람음성 세균 및 진균에 대한 항균활성을 측정한 결과, EA 추출물이 6종의 인체병원성 진균에 대해 모든 높은 항진균 활성을 나타내었다. 특히 기회성 감염을 유발하는 A. niger, C. albicans 그리고 Sa. cerevisiae에 대해 높은 억제 활성을 나타냈으며, 균배양액에서 낮은 저해율을 보였던 Ep. floccosum에 대해서도 EA 추출물은 높은 활성을 나타내었다. 따라서 다양한 인체 병원성 진균에 대해 넓은 항균스펙트럼을 가지는 Bacillus sp. BCNU 2003 균주의 활성물질 분리를 통해 특정 항균 및 항진균 물질의 대량생산 조건 등의 추가적인 연구를 수행한다면, 인체 감염증을 포함한 광범위한 피부치료제의 응용개발이 가능하리라 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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