토양으로부터 항진균 활성을 나타내는 5종류의 Pseudomonas cepacia 균주 AF027, AF069, AF2001, AF2011, SD02가 분리되었으며 이들은 각각 cyclic lipopeptide계 항진균 물질 CLP027A, CLP069A, Cepacidine A, CLP2011A, CLP02A를 생산하였다. 조사된 P cepacia 균주들은 배지중에 함유된 질소원 및 탄소원의 종류에 따라 항진균 물질 생산성에 현저한 차이가 있었는데, 질소원으로서는 polypeptone-S, 탄소원으로서는 glucose와 fructose가 생산성 증대에 가장 효과적이었다. 항진균물질 $CLP069A_1$과 $CLP069A_2$는 각각 분자량이 1215와 1199이며, 아미노산 조성, UV spectrum, IR spectrum 및 항진균 스펙트럼에 있어서, Xylocandin $A_1,\;A_2$와 일치하였으며, CLP027 $A_1$과 $A_2$ 또한 이러한 물리 화학적 특성이 Cepacidine A와 완전히 일치함으로써 동일 물질로 생각된다. $CLP2011A_1,\;A_2$와 $CLP02A_1,\;A_2$는 아미노산 조성 및 항진균 스펙트럼이 Xylocandin $A_1,\;A_2$와 다르고, Cepacidine $A_1,\;A_2$와는 항진균 스펙트럼에서 현저하게 차이가 났다. CLP2011A, CLP02A가 분자량, 아미노산 조성, UV spectrum, IR spectrum에서 Cepacidine A와 동일하지만 항진균 스펙트럼이 상이한 것은 이들이 다른 물질임을 시사하며, 이는 aliphatic side chain이 Cepacidine A의 그것과 다른 데에서 비롯된 분자구조의 상이함에서 기인된 것으로 추론된다.
우리 지역 토양환경에 도착해 살고 있는 토착 길항미생물을 분리, 선발, 육종하여 다시 지역모양으로 돌렸을 때 우점 능력이 크고 적응력이 큰 토착 생물방제균을 선발하고자 경북 경주지역에서 자연농법을 수행하고 있는 저병해경작지로부터 토착 길항미생물을 분리하였다. 이들 중 고추역병균 Phytophthora capsici의 생육을 강력히 길항하는 항생물질과 siderophore를 동시에 생산하는 복수 길항기작의 토착 길항세균 Pseudomonas fluorescens 2112를 선발하였고, 이 균주로부터 우선 항진균성 항생물질을 생산, 정제한 후 그 특성을 조사하였다. 이 항생물질은 산성 pH 조건에서는 매우 안정하였으나 알칼리성 용액에서는 불안정한 물질로 판단되었고, 또한 열에 비교적 안정하여 $80^{\circ}C$까지 30분동안 열처리하여도 항균활성을 50% 정도 유지하였다. P. fluorescens 2112로부터 이 균주의 중요 생물방제 기작인 항진균 항생물질을 단일물질 수준으로 분리하여 그 구조를 분석해 본 결과 선발된 균주가 생산하는 항생물질은 다른 Pseudomonas sp. 에서도 생산되는 것으로 알려진 2,4-diacetylphloroglucinol로 동정이 되었다. 고추역병균 P. capsici의 생육을 억제하는 토착 길항세균 P.fluorescens 2112가 생산하는 항진균 항생물질의 항균범위를 조사해 본 결과 다양한 식물병원성 진균에 방제력을 가지는 광범위 항생물질임을 확인 할 수 있었지만, Fusarium 속에 대해서는 큰 활성을 볼 수 있었다. 이 항진균 항생물질을 이용해 저해기작을 고추역병균 P. capsici의 포자를 대상으로 radioisotope labelling precursor [$^{3}$ H] Leucine, [$^{14}$ H] Glucose, [$^{3}$ H] Adenine 등으로 조사한 결과, 그 길항기작이 RNA 합성 저해로 추정되었다.
채소류 모잘록병균인 Pythium ultimun에 길항하는 미생물을 분리하기 위해 체소류 뿌리를 균원시료로 하여 약600여종의 근권미생물을 분리하였고, 그중 5종의 근권미생물이 길항력을 나타내어 가장 높은 길항력 높은 Yl-37 균주를 최종 선별하였다. 분리한 길항균 YJ-37을 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리·생화학적 특성을 조사 하였으며, 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Sherlock system을 이용하는 방법과 16S rDNA의 부분염기서열을 결정하여 동정하는 방법 등 3가지 방법으로 조사한 결과, 근권 길항미생물인 YJ-37 균주는 Bacillus ehimensis로 동정되었다. 채소류 모잘록병균 Pythium ultimun과 Rhizoctonia solani AG-4 이외에도 B. ehimensis YJ-37에 의한 병원성 진균의 길항력을 조사한 결과, Alternaria altrata, Collectotrichum gloeosporioides, Didymella bryoniae, Fu-sarium moniliforme, F oxysporum, F. oxysporum cucumerinum, F. oxysporum niveum, Gloeosporium sp., Glomerella sp., G. cingulata, G. lagenaria, Penicillium digitatum, P. itazicum, Phytophthora capsici, Sclerotinia sclerotiorum, Stemprhyzium solani등 대부분의 병원균에 대해서 항진균 활성을 나타내었다.
옻은 전통적으로 옻칠로서 사용되었으며, 최근 많은 연구를 통하여 과학적으로 그 내구성, 항균성들이 밝혀졌기 때문에 본 연구진은 옻이 최근 대두되고 있는 친환경적 방오도료의 문제를 해결할 수 있을 것으로 예상하고 있다. 따라서 본 실험에서는 옻의 주성분인 urushiol을 화학적으로 합성하고, 그 유도체들과 함께 어느 정도의 항균효과가 있는지 알아보았다. 그 결과, 본 연구진은 합성된 urushiol이 뛰어난 항진균효과를 가짐을 알 수 있었고, 항균효과 측면에서는 그람양성균에는 좋은 효과를 보인 반면 그람음성균에서는 큰 효과를 보이지 않음을 알 수 있었다. 또한 urushiol과 그 유도체들의 항균력은 균주에 따라 서로 다른 특이적 항균성을 보이는 것을 알 수 있었다.
항진균성 활성을 가지는 저영양세균을 분리하기 위하여 토양시료는 경북 영양, 충북 제천, 충북 음성, 충북 괴산, 충남 논산 등지의 고추 밭에서 수집하였고 R2A배지를 이용하여 평판희석법으로 9,354여 균주의 저영양세균을 분리하였다. 분리된 저영양세균중 고추역병에 강한 활성을 가지는 1A 균주를 선발 하였으며 16S rDNA 와 표준균주(B. vallismortis, B. mojavensis)를 이용한 생리, 생화학적 실험으로 B. vallismortis로 최종동정 되었다. 1A균주는 Magnaporthe 균을 제외하고 Phytophthora, Collectotrichum, Botrytis, Fusarium 균등에서 폭넓게 강한 활성을 나타내었다. 고추 유묘검정에서 대조구가 89%정도의 발병율을 보인 반면에 1A 처리구에서는 29%의 발병율을 나타내어 고추역병의 길항균으로써의 미생물제제 가능성이 있는 것으로 판단된다.
Bacillus subtilis AH18균주는 auxin, siderophore 그리고 cellulase를 동시에 생산하는 PGPR 균주이자 생물방제균주로 항진균성 siderophore의 특성을 확인한 결과 catechol type의 siderophore로 확인하였다. $Siderophore_{AH18}$ 의 정제는 Amberlite XAD-2, sephadex LH-20 column chromatography 그리고 HPLC를 통해 정제 및 정제여부를 확인하였으며, GC-MS, $^1H$-NMR, 그리고 $^{13}C$-NMR을 통해 구조 및 분자량을 확인하였다. 그 결과 B. subtilis AH18이 생산하는 siderophore은 분자량 883의 bacillibactin임을 확인하였으며, 포자발아억제활성을 나타냄을 확인하였다. B. subtilis AH18은 P. capsici에 의한 고추역병을 효과적으로 방제하였으며(방제력 55%), 이는 bacillibactin에 의한 효과가 포함되리라 추측된다.
다양한 생물적 스트레스로부터 경제적으로 중요한 식물을 보호하기 위한 친환경 biocontrol agents (BCAs)는 오늘날 농업 및 생태 분야에서 다양하게 사용되고 있다. 다양한 BCAs 중에서, 많은 그람 양성Bacillus 속 아종이 친환경 생물학적 살충제 및 비료로서 성공적으로 산업화되었다. 이 연구에서 우리는 식물병원성 균류의 균사생장에 길항 효과를 보여주는 BCAs 중 하나인 Bacillus thuringiensis C25가 흰날개무늬병을 일으키는Rosellinia necatrix에 대한 길항작용이 있음을 확인하였다. 주사전자현미경을 통해B. thuringiensis C25가R. necatrix의 균사 세포벽을 분해하여 균사생장을 억제하는 것을 확인하였다. B. thuringiensis C25의 전장 유전체에서 5,683 유전자 세트의 서열을 동정하였고, 잠재적으로 곰팡이 세포벽 분해 효소 (CWDE)를 암호화하는 유전자 세트를 선발하였다. R. necatrix에 대한 균사성장 억제효과는B. thuringiensis C25의 균사 세포벽 분해 유전자의 전사 활성과 높은 상관 관계가 있었다. 상세하게는, B. thuringiensis C25에서ChiA, B 및 Glycos_transf_2 유전자를 포함하는 CWDE의 전사체 수준은R. necatrix와의 공동 배양에 의해 향상되었다. 결론적으로, 본 연구에서는 B. thuringiensis C25가 R. necatrix를 제어할 수 있는 생물학적 소재가 될 수 있으며, 식물 병원체에 대한 BCA의 항진균성 메커니즘의 이해를 촉진할 수 있음을 제시하였다.
본 연구에서는 생리활성물질을 생성하는 해양미생물을 분리하기 위하여 연근해역의 해면을 조사하였다. 해면 중의 미생물은 $1.2{\times}10{\sim}2.1{\times}10^3/g$ 범위에 있었고, 이들 중 방선균은 $0.01{\sim}0.5\%$(data 생략)로 나타났다. 분리된 미생물은 각각 배양하여 항균물질을 검토하였으며, 검토하던 중에 비교적 강한 항균물질을 생산하는 균주 No. 101을 분리, 선발하였다. 선발된 균의 특징은 sclerotia로 형태가 다양하였고, 다양한 배지에서 생육이 가능하였고, 기균사의 색깔은 회백색, 배면의 색깔은 주로 회백색에서 갈색으로 나타났으며, 젤라틴 액화능과 전분 분해능을 가지나 myo-inositol은 이용하지 못하였다. 이 균의 배양학적 특성은 최적 pH 및 온도가 $6.5{\sim}7.0$ 및 $30^{\circ}C$였으며, 탄소원으로는 starch가 30g/l, 질소원으로는 casamino acid 10g/l가 적합한 것으로 나타났다. 방선균 No. 101의 균체 및 균배양액의 추출물에 대한 항균 및 항진균성에서는 Staphylococcus aureus와 Bacillus subtilis에서 강한 항균력을, 효모와 곰팡이에 대하여는 낮은 항진균성을 나타내었다.
토마토시들음병의 원인균인 Fusarium oxysporum의 생물학적 방제를 위해 경북지역의 저병해경작지로부터 항진균성 항생물질 생산성 길항미생물인 BK4 균주를 선발하였으며, 길항균주 BK4의 16S rDNA 분석 및 생화학적 특성 조사 후 최종적으로 Biolog사 동정시스템인 $MicroLog^{TM}$ 3.0을 이용하여 선발 길항균주 BK4를 Bacillus thuringiensis BK4로 동정하였다. B. thuringiensis BK4는 pH 9.0로 적정한 Nutrient broth를 이용하여 $30^{\circ}C$에서 배양할 경우 항생물질의 생산은 최대였다. B. thuringiensis BK4가 생산하는 항생물질은 $121^{\circ}C$에서 열처리시에도 $80{\%}$ 잔존활성을 유지한 내열성 항생물질이었으며, pH $3.0{\~}12.0$의 범위에서 활성의 변화를 조사한 결과 산성보다는 알칼리성에서 다소 안정적이였으나 pH 3.0에서도 $50{\%}$ 이상의 잔존 활성을 가지고 있다. B. thuringiensis BK4는 F. oxysporun에 의한 토마토시들음병에 대하여 in vivo pot상에서도 충분한 방제력을 나타내었으므로 토마토시들음병을 위시한 Fusarium속 균주가 원인이 되는 질병을 방제할 수 있는 미생물제제의 개발이 가능하게 되었다.
Bacillus mojavensis를 이용한 항진균성 및 식물 생장 촉진 활성이 최근 보고되었다. 이런 활성은 사이드로포어의 일반적 특성과 일치하여, 본 연구에서는 Bacillus mojavensis가 생산하는 사이드로포어를 고체상추출 카트리지와 액체크로마토그래피-사중극 비행시간형 탠덤 질량분석기를 이용하여 규명하였다. Bacillus mojavensis를 페놀 배지에서 16시간 동안 배양하고 동결 건조 시킨 후, 물에 용해시켜 고상추출 카트리지에 로딩하였다. 카트리지는 5% 메탄올로 세척하고 2% 포름산을 이용해 용출 시켰다. 용출액은 메탄올에 재용해 후 분석을 하였다. Bacillus mojavensis의 사이드로포어는 질량 스펙트럼의 결과를 바탕으로 882.2556의 분자량을 갖는 카테콜타입의 사이드로포어 중 하나인 bacillibactin으로 확인되었다. 이 사이드로포어 분석은 Bacillus 연구 및 기능성 식품 그리고 Bacillus mojavensis의 약학 응용 분야에 큰 기여를 할 것으로 예상된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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