옥수수는 우리나라에서 매우 중요한 사료작물이다. 대부분 사일리지 형태로 이용이 되고 있으며 많은 비율의 곡실을 함유하고 있어 반추가축의 우수한 사료로 이용된다. 본 시험은 옥수수 사일리지용 미생물 첨가제 개발을 위해 수집된 균주의 발효능력을 평가하기 위해 수행되었다. 양질의 옥수수 사일리지에서 선발한 젖산균을 0.02%의 Sodium azide가 들어있는 MRS 배지에 접종을 한 후 균을 분리하여 MRS broth에 접종하여 산 생성 능력을 조사하였다. 총 6종의 젖산균을 선발하였고 동정결과 C3-2, B13-1 및 CC9-1은 Lactobacillus plantarum으로 판명되었고 C11-4는 Lactobacillus fermentum, B14-1은 Lactobacillus paracasei, 그리고 A3-1은 Leuconostoc lactis로 동정되었다. 선발된 5종의 균주와 시판되는 2종 첨가제 그리고 무처리구를 두고 황숙기에 수확된 옥수수에 접종하여 사일리지를 제조하고 2개월 후에 개봉하여 분석한 결과 B13-1 및 CC9-1 처리구의 사일리지가 pH가 낮았고 젖산함량도 높았다. 프리그 점수와 품질등급에 있어서도 B13-1 및 CC9-1 처리구에서 가장 높게 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 Lactobacillus plantarum B13-1 및 CC9-1는 사일리지 접종제로 사용이 권장되었다.
양념에 Leu. mesenteroides, Lac. plantarum의 젖산균과 멸치액젓 첨가가 김치 양념의 대장균군 제어, 숙성촉진여부 및 관능적 특성에 미치는 영향을 조사하였다. Leu. mesenteroides과 젓갈을 첨가한 경우 초기 숙성이 촉진되나 후기 산패는 완만하였으며 Lac. plantarum의 첨가시에는 초기 숙성에는 큰 차이가 없고 후기 산패가 현저하게 진행되었다. 대장균군은 산도 0.80% 이상에서 사별되었는데 Leu. mesenteroides의 경우가 숙성이 촉진되어 보다 신속히 사멸시켰다. 총균수와 젖산균수는 초기에 starter 첨가구는 $10^6\;CFU/mL$ 정도인데 반해서 starter를 첨가하지 않은 처리구에서 총균수는 $10^6\;CFU/mL$, 젖산균수가 $10^4\;CFU/mL$ 이었고 숙성 후에는 첨가군이 높은 수준을 유지하였다. 하지만 대체적으로 스타터의 첨가가 숙성 및 대장균에 크게 영향을 주지 못하는 경향으로 동일하게 나왔다. 관능적 특성에서는 Leu. mesenteroides 첨가구가 Lac. plantarum의 경우보다 우수하였다. 한편, 시판 겉절이 김치는 산도가 $0.09{\sim}0.18%$, $pH\;5.46{\sim}5.89$, 총균수 $2.2{\times}10^6{\sim}3.1{\times}10^7\;CFU/ml$, 젖산균수 $2.1{\times}10^4{\sim}6.6{\times}10^5\;CFU/ml$, 대장균군수 $1.8{\times}10^4{\sim}7.1{\times}10^5\;CFU/ml$, 염분 $1.89%{\sim}2.51%$으로 스타터 첨가 겉절이에 비해 pH와 염도를 제외한 품질 특성에서 전반적으로 낮은 값을 나타냈다.
TLC(Thin Layer Chromatography) 는 제약산업이나 생화학 연구 그리고 여러 산업 현장에서 널리 이용되는 화학 분석 방법이다 . 본 연구에서는 적은 비용으로도 많은 양의 시료를 신속하게 분리할 수 있는 TLC를 이용하여 유기산인 젖산 (Lactic acid) 을 분리는 전개방법을 개발하였다 . 전개용매는 2 가지 용매 (1) nitroethane nitromethane : ethanol: water: I-propanol = 1 : 2 : 3 : 4 : 5 (v/v/v/v/v), (2) diisopropyl ether. formic acid. water = 90 : 7 : 3 (v/v/v) 를 사용하였다 . 발색시약은 A : bromocresol purple reagent I, B . bromocresol purple reagent II, C : bromocresol green-bromophenol blue-potassium permanganate reagent 를 사용하여 분석하는 방법을 개발하였다 $^6)$. 젖산의 분리는 silica gel TLC plate를 이용하는 경우 , 용매 (1) 에 발색시약 B를 사용했을 때 , 분리 확인이 가장 좋았다.
한국 전통 발효유인 타락을 제조하기 위하여 4종의 시판 막걸리와 시판 우유를 사용한 '타락'을 제조하여 발효 특성을 분석하였으며 관여 미생물을 분석하였다. 제조된 타락에서의 pH는 발효시간에 따라 유의적으로(P<0.001) 감소되어 pH 5.56~6.49를 나타내고 산도는 유의적으로(P<0.001) 증가하여 0.17~0.40%의 값을 나타내었다. 점도는 유청이 분리되기 전까지 유의적으로(P<0.001) 증가하였다. 당도는 유의적으로(P<0.001) 감소하였다. 에탄올 함량은 시간에 따라 증가하여 발효 24시간에 0.51~0.71 mg/mL를 나타내었다. 발효산물로는 주된 유기산이 lactic acid로 발효시간에 따라 점차 증가하여 발효 24시간에서는 모든 시료에서 전체 유기산 생성량의 80% 이상을 차지하였으며 이외에 미량의 acetic acid, citric acid, succinic acid도 검출되었다. 발효와 더불어 검출된 주된 유리당은 lactose였고 소량의 glucose가 나타났다. 타락의 젖산균 수는 발효시간에 따라 증가하여 발효 24시간에는 9.87~10.41 log CFU/mL로 나타났으며 효모 수는 6.99~7.73 log CFU/mL였다. 타락에서의 분리된 균주는 효모인 Saccharomyces cerevisiae와 다양한 Pediococcus acidilactici, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteroides 등의 다양한 젖산균이 나타났다. 따라서 타락은 효모와 젖산균이 공존하는 효모-젖산균 발효유임을 알 수 있었다.
본 연구는 EcoCal® (산화 칼슘) 및 GF Bactostop® (유기산염 믹스)을 소시지에 사용하였을 때 항균 효과를 확인하였다. 소시지 제조 시, 대조군과 0.1% EcoCal® (0.1ECO), 0.1% EcoCal®+0.5% GF Bactostop® (0.1ECO + 0.5GF), 0.2% EcoCal® (0.2ECO) 및 0.2% EcoCal®+0.5% GF GF Bactostop® (0.2ECO+0.5GF) 등 총 5개 군을 첨가하여 소시지를 제조하였다. 제조가 완료된 소시지를 진공포장하고 10주 동안 10℃에서 저장하며 7-10일 마다 시료를 균질화 하고 tryptic soy agar 및 Lactobacilli MRS agar에 도포하여 호기성 일반세균 및 젖산균을 각각 확인하였다. 그 결과, 0.1ECO+0.5GF 첨가한 소시지가 가장 효과적인 항균 효과를 나타냈으며, 0.1ECO 첨가 소시지가 두번째로 효과적인 항균 효과를 나타냈다(P<0.05). 일반세균수는 대조군, 0.2ECO 및 0.2ECO+0.5GF 첨가 소시지에서는 저장 후 42일까지 점차 증가했지만(P<0.05), 0.1ECO 및 0.1ECO+0.5GF 첨가 소시지에서는 저장 후 49일까지 일반세균의 생장이 억제되었다(P<0.05). 젖산균 수는 대조군, 0.2ECO 및 0.2ECO+0.5GF 첨가 소시지에서 약 49일까지 증가하였으나(P<0.05), 0.1ECO 및 0.1ECO+0.5GF 첨가 소시지에서 젖산균 생장이 억제되었다. 본 결과는 소시지 제형에 0.1% EcoCal®+0.5% GF Bactostop®을 첨가하면 젖산균의 생장을 억제하여 소시지의 보존 기한을 연장시키는데 유용할 것으로 판단된다.
장내 균총 개선을 위하여 조합시킨 prebiotics와 probiotics는 최고의 건강 증진을 제공할 잠재성을 갖지만, 알맞은 균주선발이 필수적이다. 기능성 식품시장은 연간 15∼20% 성장하고 있고, 그 산업은 33백만 달러의 값어치가 있다(Hilliam, 2000). 기능성 식품은 nutraceuticals, designer foods, medicinal foods, therapeutic foods,superfoods, foodiceuticals와 medifoods로 알려져 있고 그 정의는 전통적인 영양소개념을 넘어선 건강증진 성분을 함유한 식품이라고 할 수 있다(Berner와 O'Donnell,1998). 식품은 phytochemicals, bioactive peptides, $\omega$-3 불포화 지방산, 그리고probiotics 또는 기능성을 갖게 되는 prebiotics의 부가에 의하여 변형될 수 있다(Berner와 O'Donnell, 1998)(표 1). 장관에서 살수 없는 균을 함유한 요구르트의 경우와 같은 다양한 발효 낙농식품 제조에 젖산균을 사용한 이래, 오늘날에는 발효식품에Lactobacillus acidophilus와 bifidobacteria 같은 probiotic 균을 사용하는 경향이다. Probiotic 식품은 살아 있는 미생물을 함유한 식품이고, 그 미생물은 충분한 양이살아 있는 상태로 장 속에 공급되었을 때에 미생물 균총을 개선하여 소비자 건강을 증진시키는 것이라고 할 수 있다(Fuller, 1992). 전통적으로, probiotics는 요구르트와 기타 발효식품에 사용되어 왔지만, 최근에는 드링크, 알약형, 캡슐형, 동결건조물과 같은 형태로도 공급되고 있다. 오늘날, 전세계에 sour cream, buttermilk, 요구르트, 분유와 frozen desserts 같은 식품에 bifidus acidophilus를 함유한 제품이 70개를 넘고 있으며, 일본에서만도 probiotic 미생물을 함유한 형태의 우유제품이 53종류 이상 개발되어 있다. Probiotics는 유럽에서도 매우 인기가 있지만, 주로 요구르트에 한정되어 사용되고 있다(Hilliam, 2000).
염 농도$(0{\sim}3%)$와 발효 온도$(4,\;15,\;25^{\circ}C)$를 달리 하였을 때 물김치의 미생물 균총의 특성에 대한 결과는 다음과 같다. 무 물김치의 경우 총 균수는 숙성온도가 높을수록, 염 농도가 낮을수록 높게 나타났으나, 배추 물 김치의 경우 염 농도별 뚜렷한 차이를 보이지는 않았다. Lactobacillus, Lenconostoc 속 균수는 염 농도 1.0% 숙성 김치에서 가장 높게 나타났고, 배추 물김치는 $4^{\circ}C$에서 염 농도 3.0% 시료가 가장 낮은 값을 보였으며, 그 외 시료들은 온도별, 염 농도별 큰 차이가 없었다. Streptococcus 속과 Pediococcus 속은 Leuconostoc, Lactobacillus속 보다 낮은 분포를 보였고, 염 농도 1.0% 숙성 김치에서 가장 높게 나타났으며 이는 배추 물김치에서도 같은 경향을 보여주었다. 대장균수와 Gram (-)균수는 염 농도 3.0% 김치가 균수도 적었고 초기에 증가하였다가 젖산균이 증식하여 산도가 증가하면 그 수가 감소되었다. 효모는 발효 초기에는 발견되지 않다가 발효 후기에 증가하였으며 온도와 염 농도가 높을수록 균수가 증가하였다. 배추 물김치에서도 $15,\;25^{\circ}C$에서 염 농도가 높은 시료에서 비교적 높게 계수되어 무 물김치와 유사한 경향을 보였으나 배추 물김치의 경우 초기부터 효모가 계수되어 주재료간 차이를 보였다. 각각의 선택배지에서 순수분리, 동정된 균은 무 물김치의 경우 젖산균류는 염 농도 0.2% 김치에서는 Lactobacillus plantarum, L. pentosus, Leuconostoc citrum, 염 농도 1.0% 김치에서는 L. plantarum, L. pentosus, Leu.mes.ssp.mesenteroides/dextranicum, Streptococcus facium이 동정되었고, 염 농도 3.0% 김치에서는 L. plantarum, L. brevis, Leu. mes.ssp.mesenteroides/dextranicum, Str. facium이 각각 분리 동정되었으며 Pediococcus는 미확인되었다. Gram (-)균과 효모는 공통적으로 Gram (-)균으로는 Aeromonas hydrophila, 효모로는 Candida pelliculosa가 각각 분리 동정되었다. 배추 물김치의 경우 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc citrum, Leu. mes.ssp.mesenteroides/dextranicum, Streptococcus facium이 동정되었으며, Pediococcus는 역시 미확인되었다. Gram (-)균은 Pseudomonas fluorescens, Pseu. aureofaciens가 각각 분리 동정되어 주재료간 차이를 보여주었다.
폴리 젖산의 원료가 되는 젖산은 D-, L의 광학이성질체로 존재하는데 L젖산 폴리머와 라세미 폴리머는 결정성과 녹는점이 다르므로 플라스틱으로서의 만족할 만한 물성을 기대하기 위하여 원료로서 광학적으로 순수한 L-lactic acid가 요구된다. 이를 위하여 한 종류의 이성질체만을 선택적으로 생산하는 젖산균주를 탐색하여 분리함으로써 광학적으로 순수한 산물을 얻을 뿐만 아니라 이러한 발효법에 의한 젖산생산은 자연계에 풍부한 starch나 cellulose, 음식물쓰레기와 같은 재생 가능한 자원을 기질로 사용하여 젖산발효에서 전분의 당화 공정에 필요한 시간과 노력을 최소화하며 젖산 생산에 드는 전체적인 비용을 절감할 수 있다. 전분을 직접 이용하는 것은 젖산균의 일반적인 성질이 아니므로 전분이 풍부한 누룩을 수집하여 직접적으로 전분을 분해하여 젖산발효를 수행하는 균주를 누룩에서 분리하였다. 분리균주는 형태학적, 배양학적,생화학적 특성 및 16s rDNA 분석을 통하여 Enterococcus sp.으로 동정되어 Enterococcus sp. JA-27로 명명하였다. 생육에 따른 L-lactic acid의 최적 생산 조건을 검토한 결과, 최적 배지조건은 탄소원으로 1.5% soluble starch, 질소원으로 3.5% tryptone, 그 외의 다른 조성들은 0.1% $K_2$$HPO_4$, 0.04% $MgSO_4$$.$$7H_2$O, 0.014% $MnSO_4$$.$$4H_2$O, 0.04% $MgSO_4$$.$$7H_2$O이었고 최적 배양조건은 $30^{\circ}C$, pH 8이었다. 대량생산을 위한 기초자료를 제공하기 위하여 회분배양과 유가배양을 실시하였고, 회분배양이 L-lactic acid의 생산수율(0.134 g, L-lactic acid/g, soluble starch)이 더 높게 나타나 효과적이었다. 7 L 발효조 배양시 pH를 control한 결과, L-lactic acid 생산이 삼각플라스크에 비해 1.5배 더 증가하였다. 배지 중의 젖산을 정제하기 위한 방법으로 이온교환 칼럼크로마토그라피(ion-exchange column chromatography)를 사용하였고 일련의 정제 과정을 통하여 배양액 중의 L-lactic acid 정제 수율은 약 85% 정도로 나타났으며 HPLC로 분석한 결과 99.7%의 순도를 확인할 수 있었다.
Starter활성에 미치는 요인들을 조사하기 위하여 밀가루 단백질 함량, 수분첨가비율 및 다양한 영양원을 첨가하면서 starter에 내재된 미생물의 생육과 pH및 적정산도의 변화정도를 관찰하면서 최대의 활성을 나타내는 starter배합을 제시 하고자 하였다. 또한 완성된 starter를 빵 제조에 효모 대신 첨가하면서 식빵의 품질 및 관능 특성을 검토하여 천연 제빵 발효종으로서 starter의 상업적 이용 가능성을 타진하였다. 국내에서 시판되고 있는 밀가루에는 효모보다 젖산균의 수가 100배정도 더 많이 함유되어 있었다. 밀가루 단백질 함량이 많을수록 pH 및 적정산도의 변화가 적어 미생물의 생장에 더 안정적인 경향을 나타냈으며 단백질 함량은 강력분 수준(12.0%이상)이 starter 제조에 적합하였다. 수분 첨가함량이 60% 정도인 경우는 110% 이상인 경우보다 균수가 10배 이상 적었으며 수분함량이 200%인 경우는 pH및 적정산도의 변화가 커서 오히려 starter의 활성을 저해하는 경향을 나타내었다. 따라서 적정 수분함량은 강력분인 경우 110%가 적정하였다. 식염 및 설탕의 첨가는 효모 및 젖산균의 수를 크게 증가시켰으나 올리고당은 거의 영향을 미치지 않았다. 한편 설탕의 농도가 10%이상 그리고 식염의 농도가 2%이상으로 증가되면 삼투압의 영향으로 균의 생장이 억제되는 경향을 나타내었다. Starter의 시험구 중 강력분을 사용하고 수분함량 110%에 설탕 5% 및 식염 1%을 사용한 starter의 발효 팽창력 이 대조구보다 높았다. Starter를 첨가하여 만든 빵은 효모를 첨가하여 만든 빵에 비하여 체적을 제외한 모든 품질 특성에서 우수하였으며 특히 관능 특성에서 유의적으로 높은 점수를 받았다. 이상의 결과를 종합해 보면 강력분, 수분 110%, 설탕 5% 및 식염 1%를 배합하여 3일 동안 3$0^{\circ}C$에서 refresh시킨 starter는 실제 제빵시 효모의 효과적인 대체제로서 사용할 수 있으며 상업적 이용 가능성이 있는 것으로 나타났다.
젓갈은 전남 목포지역의 대형마트 및 가정에서 수집하였으며 오징어젓, 갈치속젓, 꼴뚜기젓, 멸치젓 등 10여종의 젓갈로부터 균을 분리하였다. 이들 분리 유산균 중 3균주가 인공위액과 인공담즙액에서 내성을 나타내었다. 이들 분리된 균주 중 생존력이 왕성한 3균주는 모두 인공위액에서 2시간, 인공담즙액에서 24시간 생존 가능하였다. 특히 유산균 ML 36, ML 128, ML 178 외 2종의 효모는 초기 생균수와 인공위액에서 2시간 배양 후 생균수의 변화가 거의 없어 가장 강한 내성을 나타내었다. 인공위액에서 분리된 균주의 생존율은 낮은 pH로 인하여 낮은 경향을 나타내었으나, 인공담즙액에 대해서는 높은 생존율을 나타내었다. 인공위액 및 인공담즙에 내성을 나타낸 3종의 유산균이 항생물질인 nicin, rifamycin, streptomycin, 그리고 tetracycline에 대하여 내성을 나타내었다. 또한 이들 분리 유산균은 병원성 미생물인 Listeria monocytogenes 대해 뚜렷한 항균 효과가 있는 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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