• 미생물학회지
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• 제24권3호
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• pp.243-250
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• 1986

Candida pseudotropicalis CBS 607에서의 야생형과 영양요구성 돌연변이 균주에 대한 원형질체 형성 및 재생과 상보적 영양요구성 균주간의 융합에 관해서 연구하였다. 야생형과 his tidine 혹은 adenine요구성 균주에서 원형질체 형성율은 96-100%이였으나 methionine과 tryptophan요구성 균주는 각각 52%와 72%였다. Myoinositol (0.5 mg/ml)을 첨가한 배지에서 전배양한 methionine과 tryptophan조 구성 균주는 원형질체 형성시 bovine serum albumin (BSA, 4 mg/ml)을 첨가하면 96-98%의 원형질체 형성율이 얻어졌다. 원형질체 재생 빈도는 18-20% 였으나. BSA와 myoinositol을 첨가하면 adenine요구성 균주(약 20%)을 제외한 나머지 영양요구성 균주에서는 재생율이 20% 이상 증가했다. 원형질체 융합에 대한 PEG와 $CaCl_2$,최적농도는 20%와 100mM이었고 최적 pH와 반 응시간은 각각 6.0과 30분이 있다. 상보적 영양요구성 균수의 융합빈도는 $1.5{\times}10^{-3}\;to\;8.8{\times}10^{-3}$ 였으며 원행점체의 재생 증진으로 인해 융합율이 현저히 증가했다. Histidine요구성 균주와 tryptophan 요구성 균주을 융합시켰을 때 몇개의 융합세포를 얻었는데 측정된 DNA양과 액상의 차이로 보아 aneuploid나 diploid상태임을 알 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제34권3호
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• pp.120-125
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• 1998

pNPG는 염색체 1번의 동원체 왼편에 위치하는 npgA1을 상보할 수 있는 genomic DNA를 포함하는 플라스미드인데 Aspergillus nidulans의 형질전환율을 현저히 증가시키는 특징을 보여주었다. 이 플라스미드로 형질전환시켰을 때 $Trp^+$형질전환체 모두가 $Npg^+$이었고 이들 중에 불완전 형질전환체는 전혀 형성되지 않았다. pNPG를 제한효소 PstI으로 절단하여 얻어진 10.4 kb 절편내에 형질전환율을 증가시키는 DNA서열이 존재함을 확인하고 pILJ16의 PstI site에 재조합하여 pKJH10.4라 명명하였다. pKJH10.4에 의한 A. nidulans의 형질전환율은 pILJ16 보다 대략 200배 이상 증가하였다. pKJH10.4에 의한 형질전환체를 비선택적 조건에서 배양하였을 때 $Arg^+$무성생식포자의 약 80%이상이 $Arg^-$로 복귀됨으로써 플라스미드가 매우 불안정함을 보여주었다. argB2 지표와 다른 종류의 연관된 유전자 지표를 지니는 플라스미드로 형질전환하였을 경우 비선택적 조건에서 argB2 지표가 결손될 때 연관된 다른 지표도 항상 함께 결손되는 현상을 보여주었다. 이 결과는 이 플라스미드에 의한 형질전환체의 불안정성이 염색체로 삽입되었다가 절제되어 나오기 때문이기보다는 염색체 밖에서 자가 복제하기 때문임을 시사한다. 형질전환율을 증가시키는 최소한의 DNA절편은 EcoRI-HaeIII 4.9 kb 절편이었으며 PvuII-EcoRI 2.2 kb 절편은 플라스미드의 불안정성과 관련이 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 형질전환율을 증가시키는 새로운 DNA 서열의 특성이 ANS1 보다는 AMA1과 유사하였으므로 AMA2라 명명하였다.

• 미생물학회지
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• 제47권1호
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• pp.74-80
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• 2011

Bacillus cereus에 항균활성을 갖는 박테리오신을 생산하는 유산균을 김치로부터 분리하였다. 선별한 균주는 Bergey's manual, 16S rDNA 분석을 통하여 Lactococcus lactis로 동정되었으며, L. lactis ET45로 명명하였다. ET45가 생산하는 박테리오신은 pH 3.0-11.0까지 안정하였고, 열 안정성 테스트결과 $40-121^{\circ}C$까지 안정함을 확인하였다. 박테리오신의 생산을 위한 최적 조건으로 MRS 액체배지에서 초기 pH 7.5, $30^{\circ}C$에서 18시간 배양하였을 때 최대생산을 보였다. 박테리오신의 항균활성이 proteinase K의 처리로 활성이 소실되어, 박테리오신이 단백질성 물질임을 확인하였다. 박테리오신의 분자량은 tricine sodium dodecyl sulfate polyacryamide gel electrophoresis (TSDS-PAGE)를 통하여 약 4.5 kDa임을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제47권1호
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• pp.81-86
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• 2011

Xylanase는 선형복합다당인 ${\beta}$-1,4-xylan을 xylose로 가수분해하는 효소의 한 종류이며, 종이제조공정에 응용되고 미래에 바이오 연료의 생산에 사용 될 수 있다. 동해 심층 퇴적물로부터 신종세균으로 보고된 Paenibacillus donghaensis JH8은 배지중의 xylan을 분해한다고 알려져 있으며, 여기에서는 이 효소의 특성을 조사하였다. 효소는 0.1% xylan 존재에서 최고로 유도되었으며, xylanase의 생산은 초기 대수성장기에 효소를 생산하기 시작하여, 정지기에서 약 55 miliunit에 도달하였다. 세포외성 xylanase의 최적온도와 pH는 각각 $40^{\circ}C$와 pH 6.0이였다. Xylanase의 활성은 $Ca^{2+}$ 및 $Mn^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Cu^{2+}$, $Al^{3+}$, EDTA의 존재에 의해 억제되었고, $K^+$, $Ag^+$, DTT에 의해 활성화되었다. 이 xylanase는 $40^{\circ}C$에서 120분간 활성을 유지하며 안정하였지만, $60^{\circ}C$에서는 30분에서 거의 모든 활성을 잃어버리는 특성을 보여주었다. 농축된 배양 상등액의 zymography 분석시 42 kDa의 주 밴드와 68과 120 kDa에 두 개의 아주 희미한 밴드를 나타내었다.

• 미생물학회지
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• 제46권1호
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• pp.9-14
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• 2010

본 연구는 우리나라 전통 발효식품인 장류, 김치류 및 젓갈류로부터 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 젖산균을 분리하고자 하였다. 젖산균을 분리하기 위한 선택배지로서 bromocresol purple (BCP) 한천배지를 사용하여 1차적으로 젖산균을 분리하였으며, 그 중 angiotensin converting enzyme 저해활성이 우수한 균주를 최종 선발하였다. 분리된 젖산균을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로 동정한 결과 Lactobacillus brevis ATCC $14869^T$와 99.7%의 유사도를 나타냄에 따라 L. brevis HLJ59로 명명하였다. L. brevis HLJ59는 내산성의 경우 pH가 2.0, 3.0으로 보정된 DeMan Rogosa Sharpe 액체배지에서 접종 후 각각 90분, 30분이 경과하였을 때 배양초기와 비교 시 약 99% 감소하는 결과를 보였으나, 담즙산(Bile extract)의 경우 1% 첨가 시에도 생육에 저해를 받지 않는 것으로 조사되어 L. brevis HLJ59 균주는 담즙산에 대한 내성이 우수한 균주임을 확인하였다. 항생제 내성의 경우 20종의 항생제를 paper disc법으로 조사한 결과 본 균주는 cephalosporin계의 cefoxatin (30 ${\mu}g$), ceftnaxone (30 ${\mu}g$), penicillin계의 penicillin (10 units), quinolones계 cprofloxacin (5 ${\mu}g$), nalidixic acid (30 ${\mu}g$), lincosamid계의 lincomycin (2 ${\mu}g$) 및 기타 chloramphenicol (30 ${\mu}g$)에 대해서는 내성을 가지고 있음을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제46권1호
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• pp.73-79
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• 2010

극지연구소(KOPRI)는 국내외적으로 유일하게 남북극 지역에서 분리한 저온적응성 박테리아 균주를 대상으로 culture collection(약 6,300균주)을 구축하여 운영하고 있다. 보유 중인 프로테아제(protease) 생산 균주들(총 874균주) 중에서 활성이 높은 프로테아제를 생산하는 78개의 균주들을 1차 선발한 후, 1% skim milk가 포함된 0.1${\times}$ ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도($5-30^{\circ}C$)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다. 위의 신속하고 직접적인 균주 스크리닝 방법을 통해서, 최종적으로 저온활성 프로테아제를 생산하는 15개의 저온적응성 균주들을 선발하였다. 최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, $5-15^{\circ}C$ 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다. 15개 균주들이 생산하는 각각의 프로테아제는 특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹(serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, 그리고 미분류 프로테아제)으로 분류되었다. 본 실험을 통해서 선발한 남북극 유래 박테리아 균주들은 새로운 저온활성 프로테아제를 발굴하기 위한 유용한 생물자원으로서의 가치를 가지고 있다.

• 미생물학회지
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• 제49권1호
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• pp.83-89
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• 2013

채소 재배 비닐하우스 토양으로부터 chlorpyrifos (CP) 분해능을 지니고 있는 CY6 균주를 분리하였다. 형태학적 특징 및 16S rRNA 염기서열의 계통발생학적 유사성을 기초로 CY6 균주는 Naxibacter sp.로 확인되었다. CP는 Naxibacter sp. CY6 의해 탄소 및 인의 단일원으로 이용되었다. 우리는 액체배양에서 Naxibacter sp. CY6의 다른 OP 살충제 분해 양상을 살펴 보았다. Naxibacter sp. CY6는 parathion 및 methyl parathion, diazinon, cadusafos, ethoprop를 분해할 수 있었으며, 이 때 이들은 탄소 및 인의 단일원으로 제공되었다. 또한, CP (100 mg/kg)가 함유된 토양에 Naxibacter sp. CY6 ($10^8$ CFU/g)를 접종한 것이 접종하지 않은 토양에서 보다 약 90%의 높은 분해 정도를 나타냈었다. Naxibacter sp. CY6는 살충제가 오염된 토양의 정화에 사용할 수 있는 잠재성을 지니고 있다.

• 미생물학회지
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• 제49권1호
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• pp.78-82
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• 2013

이전의 연구에서 토양으로부터 많은 양의 세포외 단백질분해 효소를 생산하는 신종 중온세균 Chryseobacterium sp. JK1를 분리하였다. 이 균주가 생산하는 단백질 분해효소의 특성조사 결과 최적반응온도와 pH는 각각 $40^{\circ}C$와 7.0이였으며, 좁은 최적온도 구간과 비교적 넓은 pH 구간인 pH 6.0-9.0에서 높은 활성을 보여주었다. 그리고 단백질 분해효소는 EDTA 또는 EGTA, PMSF와 금속이온 $Ag^+$ 또는 $Cu^{2+}$의 첨가에 의해 강하게 저해 되었으며, $Al^{3+}$의 첨가에 의해 약하게 저해되었다. Pepstatin과 금 속이온 $K^+$, $Ca^{2+}$, $Na^+$, $Fe^{2+}$ 또는 $Mg^{2+}$의 첨가는 저해에 큰 영향을 주지 않았다. 이와 반대로 단백질분해효소는 이가 금속이온인 $Mn^{2+}$ (5 mM)의 첨가에 의해 효소활성이 향상되었다. 농축된 배양 상등액의 활성염색 분석으로 67과 145 kDa 크기의 주요 밴드 두 개가 관찰되었다. 이러한 결과들로 Chryseobacterium sp. JK1 균주가 식품산업에 응용 가능한 세포외 중성의 serine 단백질 분해효소를 생산한다는 것을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제17권9호통권89호
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• pp.1248-1254
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• 2007

Kluyveromyces marxianus 유래의 exoinulinase (INU1) 분비 서열과 GAL10 promoter를 이용하여 Clostridium thermocellum endoglucanase A gene (celA)의 과발현과 분비 성능 검증연구를 수행하였다. 자체 분비 서열을 가지는 pYEG- CT1 과 INU1 분비 서열을 가지는 pYInu-CT1, 두개의 plasmid는 S. cer-evisiae SEY2102와 S. cerevisiae 2805에 각각 형질전환시켜 ur-acil이 결핍된 배지에서 선별하였다. celA gene 자체 분비 서열보다 INU1 분비 서열을 사용했을 때 발현량과 분비효율은 각각 약 $18{\sim}22%$ 와 11% 향상되었다. 이 중 361 unit/l의 발현율과 89%의 plasmid 안정성, 그리고 70%의 분비효율을 보인 S. cerevisiae 2805/pYinu-CT1 효모 형질전환체를 cellolose를 효과적으로 분해하는 재조합 효모 생균체로 선별하였다. Galactose 배지내에서 S. cerevisiae 2805/ pYInu-CT1의 발효조 회분배양 결과, 총발현량과 분비효율은 각각 418 unit/l 와 73% 로 나타났다. 또한 분비된 endoglucanase A는 분자량 100kDa 이상에서 활성 밴드를 보여, N-linked 당쇄부가에 의해 상당한 비율의 당쇄가 부가됨을 추측할 수 있었다.

• 한국유가공학회:학술대회논문집
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• 한국유가공기술과학회 1997년도 춘계 제44회 유가공 심포지움
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• pp.41-61
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• 1997

젖산균의 유전자 연구를 촉진하기 위해 간단하고 신속한 plasmid DNA의 분리방법과 electro-poration을 이용하여 vector plasmid의 간단하고 신속한 전이방법을 얻기 위해 젖산균의 형질전환에 영향하는 요인에 대하여 연구하였으며 연구결과는 다음과 같다. 1. O'Sullivan과 Klaenhammer의 방법을 개선하여 젖산균 plasmid DNA의 분리에 좋은 결과를 얻을 수 있는 신속하고 쉬운 방법을 고안하였으며, genomic DNA 분리에 이용되는 guanidium thio-cyanate 처리방법을 plasmid의 분리에 적용할 수 있었다. 2. L. casei, L. acidophilus. L. delbruekii var. bulgaricus. L. brevis와 L. plantarum 균주에서 plasmid를 확인하였으며, 돼지 분에서 분리된 L. lactis ssp. lactis. L. fermentum과 L. plantarum에서도 plasmid를 분리 확인하였다. 3. Lactococci의 plasmid분리는 lactobacilli와는 달리 mutanolysin의 처리없이도 잘 되었으며, L. lactis ssp. lactis와 Ent. faecalis에서 plasmid를 확인하였다. 4. E. coli plasimd 분리에 이용되는 MPS membrane filter 방법으로 젖산균 plasmid pLZ12의 분리가 가능하였으나, 세포파편이 filter를 막아 사용에 어려움이 있는 것으로 확인되었다. 5. Plasmid 분리없이 electroporation을 이용한 세포 대 세포 전이법으로 간편하고 빠르게 E. coli DH5${\alpha}$에 E. coli Jm109의 plasmid pBX19, pBR322를 전이시켰다. 6. L. lactis ssp. lactis 균주에 lysozyme 처리시 30${\sim}$80%의 생존율을 보였으며, 대부분의 L. acidophilus 균주의 경우 약 70%의 생존율을 보였다. L. casei 102S의 경우는 45분간 처리 시에도 100%의 생존율을 보였다. 8. L. lactis ssp. lactis 균주에 pLZ12를 6.0kV에서 전이시킨 결과 12.5kV에서보다 형질전환 효율이 훨씬 높았으며 lysozyme 처리에 의해 형질전환 효율이 증가되었다. 9. L. acidophilus 균주에 pLZ12를 전이시 6.0kV에서는 전이가 모두 이루어졌으나, 12.5kV에서는 L. acidophilus WIESBY와 NCFM에서 전이가 이루어지지 않았으며, lysozyme 처리 후 pLZ12를 전이시켰을 때 12kV보다 6.0kV에서 형질전환 효율이 증가되었다. 10. Gene Pulser와 Progenitor II를 사용하여 pLZ12를 L. lactis ssp. lactis 균주에 전이하였을 때 Gene Pulser에 비해 Progenitor II의 형질전환 효율이 현저히 떨어졌다. L. acidophilus HY7008과 HY7001은 두 기기 모두 형질전환이 이루어졌으나, L. acidophilus WEISBY와 NCFM은 Progeni-tor II에서 전이가 일어나지 않았으며, Gene Pulser에서 전이균주를 얻어 두 electroporator간에 형질전환 효율의 차이를 보였다. 11. L. casei 102S에 pLZ12를 electroporation시 낮은 전압에서 형질전환 효율이 비교적 좋았으며, 배양 시기를 달리하여 전이시켰을 때 대수생장 말기의 세포가 형질전환 효율이 좋았다. 12. L. casei 102S세포를 각각 10% glycerol, EB, 2차 증류수 등에 녹여 electroporation을 실시하였을 때 각각 $3.8{\times}10^3$, $5.0{\times}10^2$,1.5${\times}10^2$cfu의 형질전환 효율을 보였으며, 1.0mM HEPES, TE buffer를 사용하였을 때에는 전이가 이루어지지 않았다. 13. Plasmid pLZ12의 농도를 달리하여 electroporation을 하였을 때 형질전환 효율이 농도에 비례하여 증가하였다. 14. L. casei 102S에 대수생장 말기의 세포를 채취하여 10% glycerol, 200 Ohms, 25 ${\mu}$FD, 10kV/cm로 plasmid pLZ12를 electroporation할 때 최대 형질전환 효율인 3.8${\times}$10$^{3}$cfu를 얻었으며, lysozyme 처리가 다른 젖산균과는 달리 형질전환 효율을 증가시키지 못하였다. 15. L. casei 102S 세포를 10% glycerol과 EB에 녹여 -20$^{\circ}C$에서 냉동시킨 다음 1일과 7일 후의 세포를 electroporation한 결과 냉동시 세포에 손상을 주는 것으로 인식되었다.