본 연구에서는 미역이나 다시마에 많이 분포하면서 항산화작용이 탁월한 알긴산올리고당의 방사선 방어효과를 알아보기 위해 3 Gy 방사선이 전신 1회 조사된 마우스를 가지고 IL-6을 측정하였다. 측정 결과 방사선조사대조군과 비교하여 볼 때 소장과 간 조직 모두 방사선조사 전 7일간 알긴산올리고당의 처치를 시행한 그룹에서 IL-6 생성이 억제됨을 관찰하였다(p < 0.001). 이는 알긴산올리고당이 항산화작용을 통해 방사선이 피폭된 생체조직을 방어함으로써 IL-6의 생성을 억제한 것으로 사료된다. 결론적으로, 본 연구를 통해 알긴산올리고당의 일부 방사선 방어효과를 규명했고 아울러 화학적 독성이 없는 자연산생물이 방사선 방어제로 활용될 수 있을 가능성을 확인하였다.
본 연구는 고콜레스테롤 식이를 급여한 마우스의 지질대사에 알긴산 올리고당이 미치는 영향을 조사하였다. 실험동물은 4주령 된 수컷 apoE 마우스를 사용하였으며, 정상군, 고콜레스테롤 식이대조군, 알긴산 올리고당 5%와 10% 첨가군으로 나누어 6주간 급여하였다. 실험식이는 AIN-93G 식이를 기본으로 하여 콜레스테롤(1%, w/w)을 혼합하였으며, 알긴산 올리고당을 각각 5%와 10% 수준으로 혼합하였다. 실험기간 동안 증체량은 고콜레스테롤 식이대조군에 비해 알긴산 올리고당 10% 첨가군이 약 7.6% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 장기조직 중 신장 주변지방과 부고환지방의 무게는 고콜레스테롤 식이대조군이 정상군에 비해 각각 42.6%, 27.6% 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 반면 알긴산 올리고당 첨가군은 신장 주변지방과 부고환지방 무게가 고콜레스테롤 식이대조군보다 2배 이상 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 고콜레스테롤 섭취는 혈청 중 총 콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤 수준을 정상군보다 각각 16%, 12%, 47.1% 유의적으로 증가시켰으며, 반면에 알긴산 올리고당 10%를 섭취한 경우 고콜레스테롤 식이대조군보다 각각 57.5%, 51.4%, 82.9% 유의적으로 감소시켰다 (P<0.05). 혈청 HDL-콜레스테롤 함량은 실험군간 유의적 차이는 크게 나타나지 않았으나, 전체 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 비율에서 알긴산 올리고당 첨가군이 유의적으로 높았다(P<0.05). 간 조직 내 지질 수준은 고콜레스테롤을 섭취했을 경우 정상군에 비해 유의적으로 증가하였으나, 알긴산 올리고당 10%를 섭취했을 때 고콜레스테롤 식이대조군보다 총 콜레스테롤 함량은 3배 이상, 중성지방 함량은 33.5% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 고콜레스테롤 식이군에서 나타난 분변 내 총 콜레스테롤 함량은 알긴산 올리고당 10% 첨가군에서 정상군보다 21% 유의적으로 증가하였다(P<0.05). 이상의 실험 결과 고콜레스테롤 식이와 알긴산 올리고당을 함께 섭취한 마우스는 체중 감량과 장기 내 지방의 중량을 감소시켜 비만 예방효과가 있고, 혈액, 간지질 및 분변 지질 수준의 개선 효과가 높아 지질대사와 관련된 만성질환 예방에 효과가 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 알긴산올리고당의 일부 방사선 방어효과를 규명하기 위해 마우스에 3 Gy 선량의 방사선을 1회 전신 조사하여 방사선 유도 nitric oxide를 측정하였다. 측정결과 방사선조사 대조군에서 nitric oxide 생성이 하강된 반면 방사선조사 전 3일간 처치군 및 방사선조사 후 3일간 처치군에서 유의한 생성 증가를 보였고, 특히 방사선조사 전 3일간 처치군에서 가장 큰 차이를 보였다(P<0.001). 결론적으로, 항산화효과가 탁월한 알긴산올라고당은 nitric oxide의 생성 증가를 촉진시킴으로써 일부 방사선 방어작용을 수행한다는 사실을 규명하였고, 화학적 독성이 적은 자연산생물이 방사선방어제로 활용될 수 있음을 확인하였다.
6종류의 알긴산을 기질로하여 효소 반응을 시켜 알긴산 올리고당 제조를 시도한 결과, 실험에 사용한 효소의 경우 G-rich block에만 특이하게 작용하는 guluronate lyase 일종으로 G-block에 주로 작용하여 올리고당을 생성하는 것으로 확인되었다. 또한 4종류의 시판 알긴산중에서도 1종(Wako Co.)의 Na-alginate에 대해서 특이하게 6-7개의 올리고당 spot가 TLC에서 확인되었고, 그외 3종의 Na-alginate는 2-4개 정도의 올리고당 spot가 TLC에 나타났다. 6-7개의 spot가 확인된 Na-alginate(Wako Co.)를 기질로 대량 분해시킨 후 Sephadex G-25 및 Bio-gel p-2로 분획, 정제를 행하고 중합도를 측정하여 올리고당을 확인한 결과, 중합도가 각각 다른 4개의 올리고당을 확인할 수 있었다.
알긴산 올리고당은 생체에 다양한 생리활성효과를 나타내는 기능성 식품의 소재나 고부가가치 재료로서 활용 가능성이 높아 여러 응용 범위 내에서 사용될 수 있다. 알긴산은 해조류의 주요 구성성분으로 주로 갈조류에 많이 존재한다. 해조류로부터 다양하게 활용이 가능한 알긴산 올리고당을 제조하기 위해 Erwinia tasmaniensis 균주가 생성하는 효소를 이용하여 알긴산을 효소적으로 분해하고자 하였다. 따라서 본 연구에서는 E. tasmaniensis의 최적 배양조건과 균주가 생성해내는 알긴산 분해 효소의 성질 및 특성을 알아보았다. 실험 결과, 이 균주의 최적 배양을 위한 배지 내 알긴산의 최적 농도는 1.0%, 최적 시간은 36 h이었으며, 알긴산 분해 효소의 활성은 알긴산이 1.0% 포함된 배지에서 72 h동안 배양했을 때 가장 높았다. 이 효소의 최적 pH는 6.0, 최적 온도는 $20^{\circ}C$로 확인되었다. 또한 효소의 활성은 $20^{\circ}C$에서 60 min까지 지속됨을 확인했다.
유기산을 이용한 알긴산의 분해 및 올리고당화 조건을 검색한 결과, 유기산 종류와 농도에 관계없이 $100^{\circ}C$ 이하의 온도 조건은 알긴산을 올리고당으로 분해하는데는 적절하지 못하였다. 반면, $110^{\circ}C$와 $120^{\circ}C$ 조건은 유기산 종류와 농도에 따라 다소의 차이는 있었으나 올리고당화할 수 있는 조건이었으며, 마이크로파 처리나 초음파 처리와 같은 물리적 가열 처리 방법은 알긴산 분해에 효과적인 방법이 아닌 것으로 확인되었다. 분해율의 측면에서 최적 분해 조건은 citrate나 malate로 $120^{\circ}C$에서 120분 가압가열처리하는 조건이었으나, TLC 상에서 $110^{\circ}C$에서는 $3\~4$개, $120^{\circ}C$ 처리 조건은 $7\~8$개의 올리고당 획분이 확인되었다. 이상의 결과로 미루어 보아 유기산을 이용한 알긴산 올리고당 생산은 $0.5\%$ citrate를 이용하여 $120^{\circ}C$에서 90분 동안 가압가열처리하는 것이 최적의 조건이었다.
본 연구에서는 산업적으로 응용가능한 알긴산 올리고당을 효소적 분해를 이용하여 제조하기 위한 기초 연구로서 해조류로부터 알긴산 분해 활성이 우수한 미생물을 탐색하고, 분리하여 알긴산 분해 효소를 생산하는 미생물의 최적 생육 조건 및 그 조효소액의 알긴산 분해 특성을 알아보고자 하였다. 갈조류인 지충이로부터 균주를 분리하였고 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, Vibrio sp. V140으로 동정되었으며 PKA 1003으로 명명하였다. Vibrio sp. PKA 1003균주의 최적 생육 특성을 알아본 결과, pH 7, 3% NaCl, $25^{\circ}C$ 및 48시간이었으며, 6% 알긴산과 1:1 배양 시 분해 효율이 가장 좋은 것으로 나타났다. Vibrio sp. PKA 1003 균주가 생산하는 조효소의 알긴산 분해 최적 조건은 pH 9, $30^{\circ}C$, 6% 알긴산 및 63시간으로 나타났으며, 배양 시간에 따라 TLC를 실시한 결과, 배양 12시간부터 서서히 분해되어 2개의 spot을 형성하는 것을 확인하였으며, 조효소액에 의해 알긴산이 여러 가지 단당 또는 올리고당으로 저분자화되는 것을 확인하였다. 또한 조효소액에 trypsin을 처리하여 실험한 결과, trypsin 처리구 및 조효소액 처리구의 환원당 생성량이 각각 70.91 및 $538.62{\mu}g/mL$로써 알긴산 분해 활성이 효소에 의한 것임을 확인하였다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때, Vibrio sp. PKA 1003의 최적 생육 조건 및 알긴산 분해 최적 조건에서 알긴산 분해 효소 및 알긴산 올리고당을 효율적으로 획득할 수 있을 것으로 사료된다.
부산 송정 연안에서 해조류 및 해수로부터 알긴산 분해 미생물을 분리동정하고 미생물의 생육 조건 및 조효소액의 알긴산 분해 특성을 확인하였다. Sargassum thunbergii로부터 분리한 알긴산 분해균을 동정한 결과, Vibrio crassostreae strain로 확인 되었으며, V. crassostreae PKA 1002로 명명 하였다. V. crassostreae PKA 1002 최적 생육 조건을 확인한 결과, pH 9, 2% NaCl, $30^{\circ}C$ 및 배양 24 hr인 것으로 나타났으며, 최적 생육 조건에서 7% 알긴산과 1:1 배양시 환원당이 가장 많이 생성되는 것으로 나타났다. V. crassostreae PKA 1002를 최적 생육 조건으로 대량배양 후, 원심분리하여 얻은 상층액을 조효소액으로 하였으며, V. crassostreae PKA 1002 유래 알긴산 분해 조효소액은 pH 9, $30^{\circ}C$에서 분해 활성이 최대이며, 4% 알긴산 용액에서 1 hr 반응시 3.035 g/L의 환원당을 생성하는 것으로 나타나 추후 효소를 정제하고 알긴산 분해 특성을 구명하여 알긴산 올리고당 제조에 이용할 수 있을 것으로 사료되어 진다.
For the induction of arthropathy, 5% hydrogen peroxide($H_2O_2$) was injected for 5 weeks into the intraarticular space of the New Zealand white rabbits to damage articular cartilage. Alginic acid of low molecular weight (2%) made from macromolecular alginate treated with enzyme was administered into articular space at the dose of 5 mg/kg twice a week for 3 and 6 weeks using 1 ml syringe and 26 G needle. Saline was injected for the control. Tissues surrounding the articulation were obtained for the measurements of superoxide dismutase(SOD) activity as a major antioxidant enzyme and malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation level. Histopathologic examination on the surface of articular cartilage was carried out. Data showed that injection of hydrogen peroxide for 5 weeks had led to the induction of free radical damage and of articular cartilage change as confirmed by microscopic observation. The application of hydrogen peroxide caused a gradual increase in the SODs and MDA. These patterns were similar after 3 and 6 weeks of alginate treatment. Furthermore, microscopic examinations revealed that hydrogen peroxide caused flaking, fibrillation, fissuring, denudation, and hypocellularity in the articular surfaces. In conclusion, lipid peroxidation was demonstrated in the articular cartilage by the administration of hydrogen peroxide in the rabbit model. This lipid peroxidation could be caused by oxygen free radicals. The histologic and enzymatic correlations on lipid peroxidation in the articulation have provided a better understanding of arthropathy. It is possible to take advantage of these findings to evaluate effective alginate dosage more efficiently.
The anti-inflammatory effect of alginate oligosaccharides on LPS-induced RAW 264.7 cells was investigated at different time points (0-60 h). The alginate oligosaccharides were produced by an alginate-degrading enzyme from Shewanella oneidensis PKA1008. The alginate oligosaccharides decreased the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines [tumor necrosis factor-${\alpha}$, interleukin (IL)-$1{\beta}$, and IL-6] in a dose-dependent manner. The alginate oligosaccharides showed peak anti-inflammatory activity after 36 h of incubation; at that time point, reduced protein expression of NF-${\kappa}B$ p65, iNOS, and COX-2 was detected. Furthermore, the alginate oligosaccharide treatment reduced the formation of ear edema at 36 h compared to samples examined at 0 h when the oligosaccharides were administered at 50 and 250 mg/kg body weight, as well as dermal thickness and mast cell numbers in a histological analysis. These results suggest that alginate oligosaccharides are a promising anti-inflammatory agent.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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