• 식품산업과 영양
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• 제2권1호
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• pp.7-9
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• 1997

내열설 미생물, Thermus caldophilus CK24에 대한 탄수화물 생합성을 연구하는 과정에서 다양한 탄수화물 관련효소를 탐색하고 그레 대한 생화학적 및 분자생물학적 연구를 수행하고 있다. 일차로 내열성 미생물내 1) 당핵산염 합성효소와 당전이 효소, 2) 탄수화물 대사효소. 3)탄수화물 분해 및 전환효소의 존재를 HPLC/Bio-LC분석을 통하여 확인하고 이들에 대한 연구를 진행하고 있다. 본 연구발표에서는 포도당을 과당으로 전환하는 이성화효소(xylose isomerase), 그리고 맥아당을 트레할로스로 전환하는 트레할로스 합성효소(trehalose synthase)를 소개하고저 한다. 이성화효소는 이미 산업적 과당 생산에서 대규모적으로 사용되고 있는 식품산업효소이다. 본 연구에서는 Thermus caldophilus GK24, Thermus thermophilus HB8, Thermus flavus AT62 3종의 내열성 미생물에 대한 이성화효소 유전자를 클로닝 하고, 각 재조합하고 이성화효소를 대량생산하였다. 이 내열성 이성화효소는 최적 반응 온도가 8$0^{\circ}C$이고, 포도당을 과당으로 전환하는 수유른 55%이었다. 이러한 과당전환률은 이미 산업적으로 사용되고 있는 이성화효소의 과당전환률(43%)보다 훨씬 높은 것으로 과당 생산공정의 단순화의 생산성 향상에 결정적인 요인이라 할 수 있다. 한편 본 이성화효소의 산업적 특성을 증대하기 위하여 구조-기능관계 연구를 착수하였다. 우선 내열성 이산화 효소의 입체 구조를 결정하였고, 구조조정에 따른 기능적 특성을 조사하기 위하여 특정 위치의 선택적 변이 연구를 진행하고 있다. 끝으로 포도당 전이 효소를 추적하던 과정에서 맥아당을 트레할로스로 전환하는 새로운 효소를 Thermus caldo-philus GK24에서 발견하였다. 그 트레할로스 합성효소는 분자량이 약 110kDa이고 최적 반응온도가 75$^{\circ}C$이면, 조효소없이 맥아당을 트레할로스로 80%이상 전환해 주는 가역효소이었다. 본 연구에서는 효소반응의 조건과 특성을 조사하였고, 효소 아미노-밀단의 서열결정정보를 통하여 효소의 유전자를 클로닝 하고 그 유전자의 구조와 발현연구를 진행하고 있다.

• KSBB Journal
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• 제23권1호
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• pp.44-47
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• 2008

Streptomyces peucetius가 생산하는 anthracycline 계열의 doxorubicin은 치료목적으로 사용되는 중요한 항암제 중 하나이다. Doxorubicin은 rhodomycin D에서부터 몇 단계의 생합성 과정을 더 거쳐 생산되는데, 생물학적 활성을 갖기 위해서는 deoxy-sugar의 전이가 반드시 일어나야 한다. 본 논문에서는 이종균주인 Streptomyces venezuelae에 11개의 유전자를 형질 전환하여 TDP-L-daunosamine를 생산하고 이것을 ${\varepsilon}$-rhodomycinone에 전이하여 rhodomycin D를 생산하는 연구를 수행하였다. S. peucetius 유래의 7개 유전자 dnmU, T, J, V, Z, Q, S.를 당 합성 및 전이를 위해 plasmid 형태로 전이하였으며, S. venezuelae의 desIII, IV와 doxorubicin 내성 유전자인 drrA, B는 chromosomal DNA에 삽입하였다. Aglycone 기질인 ${\varepsilon}$-rhodomycinone을 확보하기 위하여 6L의 고체 배지에 S. peucetius를 배양하여 유기용매로 추출하고 preparative HPLC로 분리 정제하였다. 결과적으로 이종균주인 S. venezuelae에서 ${\varepsilon}$-rhodomycinone에 당 전이가 일어난 생산물을 확인함으로써 deoxy-sugar의 생합성 및 전이에 필요한 최소한의 유전적 정보를 확인할 수 있었다. 또한, 유사서열 단백질 모델링을 통하여, 최초로 당 전이 반응에 필수적인 도움효소 DnrQ의 구조를 예측하였다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제62권4호
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• pp.361-366
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• 2019

Isorhamnetin 3-O-glucoside는 플라보놀 그룹에 속하는 물질로서 염증이나 궤양에 효과가 있을 뿐만 아니라 신경장해, 신장병증, 망막증과 같은 당뇨합병증을 완화하는 것으로 보고되었다. Isorhamnetin 3-O-glucoside는 Tetraena aegyptia, Salsola oppositifolia, Salicornia herbacea, Sambucus ebulus와 같은 몇몇 식물에서 발견된다. 생물전환은 저렴한 화합물로부터 고부가가치 물질을 생산할 수 있는 유용한 방법이다. 본 연구에서 생물전환을 통해 quercetin으부터 isorhamnetin 3-O-glucoside를 생합성 하기 위해 두 개의 유전자(PGT E82L과, ROMT-9)를 각각의 대장균에 도입하였다. 대장균의 공조배양시스템을 이용하여 isorhamnetin 3-O-glucoside 생산 배양법의 최적화를 위해 생물전환배지, 배양온도, 세포의 혼합비율, 재조합 단백질 유도시간, 기질 공급 농도 등을 테스트하였다. 최적화된 생물전환 조건하에서 생물전환을 실시하였으며, 배양의 12시간 후 181.2 mg/L의 isorhamnetin 3-O-glucoside가 생합성 되었다. 이는 이전의 연구에서 보고된 isorhamnetin 3-O-glucosie (39.6 mg/L)의 생합성보다 4.7배 높았다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제64권3호
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• pp.309-316
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• 2021

Trifolin (kaempferol 3-O-galactoside)는 플라보놀 그룹에 속하는 물질로 아토피, 항균, 폐암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. Trifolin은 다양한 식물에서 추출하여 사용하고 있지만 추출 과정이 복잡하고, 수율이 낮으며, 추출을 위한 바이오매스를 얻는데 계절적 어려움이 있다. 생물전환은 저렴한 화합물에서 고부가가치 화학물질을 생산할 수 있는 대체 수단으로 이용된다. 본 연구에서는 naringenin으로부터 trifolin을 생합성하기 위해 3개의 유전자(PeFLS 및 OsUGE-PhUGT)를 각각의 대장균에 도입한 BL-FLS균주와 BL-UGTE균주를 이용하여 공조배양시스템을 개발하였다. Naringenin으로부터 trifolin을 생합성하기 위해 세포의 밀도, 생물전환 온도, 재조합 단백질 유도의 적정 IPTG농도 및 시간, 기질 공급 농도 등의 최적화를 실시하였다. 최적화된 공동 배양 발효 시스템을 통해 67.3 mg/L의 trifolin을 성공적으로 생합성 하였다.

• 한국응용곤충학회지
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• 제57권3호
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• pp.165-175
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• 2018

곤충은 넓은 범위의 온도영역에 사는 것으로 알려져 있으나, $40^{\circ}C$가 넘는 고온이나 빙결온도 이하의 저온에서는 생존이 어렵다. 본 연구는 사육온도 조건이 다른 환경에서 대사중심 조직인 지방체의 유전자 발현을 분석하기 위해, 온도조건을 달리하여 담배나방을 저온 사육충 ($3{\sim}10^{\circ}C$), 고온 사육충 ($35^{\circ}C$)로 나누고 상온 사육충 ($25^{\circ}C$)을 대조구로 사용하여 전사체 분석을 수행하였다. 저온에서 특이적으로 높은 발현을 보인 유전자는 표피단백질, ${\Delta}9$ 불포화효소, 글리세롤 3-인산 탈수소효소이며, 저온에서 발현이 낮아진 유전자는 키틴 합성효소, catalase, UDP-당전이 효소이다. 고온에서 특이적으로 높은 발현을 보인 유전자는 과산화물제거효소, metallothionein 2, phosphenolpyruvate carboxykinase, 트레할로스 운반단백질이었다. 고온에서 높고 저온에서 낮은 대조적 발현을 보인 유전자는 열충격단백질, glutathione peroxidase이었다. 이들 온도 특이적이거나 대조적 발현을 보이는 유전자는 기후변화에 관련한 특이마커로 활용이 가능할 것으로 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권3호
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• pp.363-369
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• 2016

Listeria innocua ATCC 33090 유전체로부터 maltose/maltodextrin 이용과 관련한 유전자 클러스터를 발견하였으며, 그로부터 cyclomaltodextrinase (LICD)로 예상되는 유전자를 클로닝하고, 대장균 내에서 발현하였다. LICD는 총 591개의 아미노산으로 이루어진 68.6 kDa 크기의 효소이며, 일반적인 CDase 계열 효소들과 39−58%의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 재조합 LICD는 37℃, pH 7.0의 조건에서 최대 활성을 나타내었으며, cyclodextrin, starch, maltotriose에 작용하여 주로 maltose를 생성하였다. 또한 pullulan을 분해하여 panose를, 그리고 acarbose를 분해하여 glucose와 acarviosine-glucose를 생성하는 전형적인 CDase 계열 효소임을 확인하였다. 그러나, starch 및 pullulan과 같은 고분자기질 대비 cyclodextrin 및 maltotriose의 저분자 소당류에 대해 상대적으로 높은 활성을 나타내며, acarbose 분해 활성이 매우 낮아 다른 효소들과 차별성을 가진다. 또한 LICD는 acarbose 공여체를 가수분해하여 수용체에 전이하는 당전이 활성을 보였다.

• 생명과학회지
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• 제28권4호
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• pp.389-397
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• 2018

당 단백질에 붙어 있는 당사슬 구조는 형질전환 돼지 유즙으로 분비되는 의약용 단백질의 생물학적 활성, 안정성 그리고 안전성에 영향을 줄 수 있다. 형질전환 동물을 이용한 치료용 당 단백질 생산은 유선 세포에서 이루어지는 당사슬 부가능력에 의해 제한되며, 균일한 당사슬 형태를 가지는 당 단백질 생산은 도전 과제로 남아있다. ${\beta}$-1,3-N-acetylglucosaminylatransferase1 (B3GNT1) 유전자는 N-아세틸글루코사민에 갈락토오스 잔기를 부착시키는 단백질 당화기작에 중요한 효소이지만, 돼지 당 전이효소에 대한 정보는 매우 제한적이다. 따라서, 돼지 B3GNT1 (pB3GNT1) 유전자를 클로닝하고 N-아세틸글루코사민에 갈락토오스 잔기를 부착시키는 기능적 특성을 조사하였다. 몇가지 다른 프라이머를 사용하여 전체 전사영역(ORF)을 함유하는 부분적인 pB3GNT1 mRNA 염기서열을 간 조직으로부터 분리하였다. 클로닝 된 pB3GNT1의 ORF는 1,248개의 뉴클레오티드를 가지며, 415개 아미노산 잔기로 구성되어 있었다. pB3GNT1 유전자의 장기별 발현특성은 성돈 및 자돈의 여러 기관에서 분석하였다. pB3GNT1 mRNA 발현 수준은 심장, 소장 보다는 근육에서 높았지만 폐에서는 낮았다. pB3GNT1의 기능적 특성 분석을 위해 돼지 신장 세포주(PK-15)에서 pB3GNT1 유전자의 안정적인 발현을 확립하였다. 그 결과, PK-15 세포에서 pB3GNT1 발현에 의한 당화 패턴은 총 시알산 증가에는 영향을 미치지 않지만, poly-N-아세틸글루코사민은 증가하는 것으로 나타났다. 본 연구는 생물반응기로 형질전환 돼지를 이용할 때 희망하는 당사슬을 부가하여 치료 가능성을 높이며 개선된 활성을 나타내는 당단백질 생산에 도움이 될 것이다.

• 미생물학회지
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• 제53권3호
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• pp.208-215
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• 2017

Streptococcus pyogenes ATCC 700294 유전체로부터 cyclomaltodextrinase (SPCD)로 예상되는 유전자를 발견하였다. SPCD는 총 567개의 아미노산으로 이루어진 66.8 kDa의 효소이며, 기존에 알려진 CDase 계열 효소들과 37% 미만의 아미노산 서열 상동성을 가진다. 본 연구에서는 SPCD 유전자를 클로닝하였으며, 대장균 내에서 카복시 말단에 6개의 histidine 잔기가 결합된 dimer 형태로 발현 및 정제되었다. SPCD는 pH 7.5, $45^{\circ}C$의 반응조건에서 최대의 활성을 나타내었으며, ${\beta}$-cyclodextrin, starch, maltotriose를 기질로 반응하여 maltose를 주산물로 생성하였다. 또한 pullulan을 panose 단위로 분해하며, acarbose를 glucose와 acarviosine-glucose로 가수분해하는 CDase 계열의 효소로 확인되었다. 그러나, SPCD는 다른 효소에 비해 저분자 소당류인 ${\beta}$-cyclodextrin에 대한 활성이 매우 높고, starch 및 pullulan과 같은 고분자 기질에 대해 매우 낮은 활성을 보였다. 또한 maltotriose 분해 활성이 매우 낮은 반면 acarbose에 대해 상대적으로 높은 가수분해 활성을 가지나, 당전이 활성은 매우 낮아 다른 CDase 계열 효소들과 구별된다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권5호
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• pp.309-314
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• 1994

간편하면서도 효율적인 단자엽 식물의 형질전환 기법을 개발하기 위하여 배발생 세포를 직접 electroporation하여 DNA를 도입하는 실험을 벼와 잔디에서 실시하였다. 잔디는 수정 후 3주된 미숙배에서 캘러스를 유도하였으며, 2.4-D가 1 mg/L 함유된 액체 MS배지로 옮겨 진탕배양한 것을 electroporation 실험에 이용하였다. 벼는 20 mm 정도의 미숙화서 유래의 캘러스를 액체 N$_{6}$배지(1 mg/L 2.4-D 함유)에서 진탕배양하여 획득한 세포주를 사용하였다. 액체 진탕배양한 세포괴를 GUS expression vector인 pGA1074 (30 $\mu\textrm{g}$/ml)와 함께 MS 액체 배지에서 Electroporation하였다. 세포벽과 세포막을 통한 세포로의 DNA 전이는 GUS 유전자의 발현 여부 및 정도에 따라 결정하였다. 400 volt, 800 $\mu$F capacitance로 electroporation 처리된 벼와 잔디의 세포괴들은 200 ${\mu}\ell$ (packed cell volume)의 세포괴 당 25 unit (1 unit=파란색을 띤 독립된 세포군) 이상의 빈도로 GUS 활성을 나타내었다. 반면에 무처리 세포주 및 처리한 비배발생 세포주에서는 GUS 발현이 일어나지 않음을 반복적으로 확인차였다. 따라서 electroporation에 의한 벼와 잔디의 형질전환실험에서 원형질체 대신 intact한 배발생 세포가 이용될 수 있음을 의미한다

• 생명과학회지
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• 제26권3호
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• pp.275-281
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• 2016

인체치료용 당단백질은 바이오의약품에 있어서 중요한 요소이며 특히, 단백질 말단에 결합되어있는 시알산은 의약품의 체내 활성이나 안정성에 큰 영향을 미친다. 최근 돼지유즙은 바이오의약품을 생산하기 위한 생체반응기로써 주목받고 있다. β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase A (MGAT4A)는 재조합단백질이 가지는 시알산 함량을 늘리기 위한 필수 효소 중 하나이다. 그러나 돼지 MGAT4A는 아직도 그 서열이나 기능이 불분명하다. 따라서 이번 연구에서는 돼지 MGAT4A의 서열 동정 및 기능분석을 하였다. 돼지 MGAT4A는 535개의 아미노산을 코딩하는 1,638개의 염기서열로 이루어져 있으며, 일반적인 당전이효소들의 특징인 type II membrane topology의 특성을 가지고 있다. Real-time PCR분석법을 통하여, 지금까지 알려진 것과는 조금 다르게 MGAT4A 유전자가 간이나 유선에서 많은 발현을 보였으나 소장이나 위, 방광에서는 그 발현량이 적다는 것도 확인하였다. 또한, 효소의 기능 분석을 위하여 PK-15 세포주에서 MGAT4A효소의 과발현을 유도하였다. 과발현이 확인된 세포주로 렉틴을 이용한 면역형광염색법과 ELISA방법으로 MGAT4A효소의 과발현이 β-1,4-N-acetylglucosamine의 함량을 증가시켰음을 확인하였다. 또한 기질반응을 통해 bi-antennary structure에 대한 반응성도 확인하였으며, MGAT4A의 과발현이 유도된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였다. 이러한 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는데 있어서 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다.