• 식물조직배양학회지
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• 제22권2호
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• pp.95-99
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• 1995

본 연구는 이미 확립되어 있는 고려인삼의 체세포배발생을 통한 식물체 재분화와 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환 시스템을 이용하여 항곰팡이성 인삼을 개발하고자 염기성인 강낭콩 키틴가수분해효소 유전자를 인삼으로 도입하였다. CaMV 35S promoter-강낭콩 키틴가수분해효소 유전자와 선발표지로서의 neomycin phosphotransferase II (NPT II) 유전자를 가진 pChi/748 binary 벡터를 pGA748로부터 제조하여 이를 도입한 A. tumefacience LBA4404와 인삼 접합배의 자엽절편을 1 mg/L 24-D, 0.1 mg/L kinetin이 첨가된 MS 액체배지에서 48시간 동안 공동배양한 후 동일배지에 100 mg/L kanamycine 500 mg/L carbenicillin을 첨가한 고체 배지에 옮겨 배양하였다. 배양 한달 후부터 절편의 절단면 부근으로부터 캘러스가 유도되기 시작하였으며 이어서 수많은 체세포배가 형성되었다. 이들 체세포배를 BA와 GA3가 각각 1 mg/L 첨가된 배지로 옮겨서 5주 경과되었을 때 식물체로 전환되었다. 재분화된 개체 중 선발된 8개의 식물체로부터 PCR과 이 산물의 Southern분석 결과 6개의 재분화 개체에서 강낭콩 키틴가수분해효소 유전자가 도입되었음을 확인하였다.

• 식물조직배양학회지
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• 제22권6호
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• pp.329-334
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• 1995

효과적인 형질전환 시스템을 이용하여 왜화유전자인 rolC 유전자를 구기자나무로의 형질전환 시스템을 확립하였다. 침으로 자극된 엽절편을 2.0 mg/L zeatin이 함유된 3/2 MS배지에 배양하였을 때 엽표면으로부터 줄기재분화가 되었다. 그러나 여러 농도의 kanamycin sulfate와 2.0 mg/L Aeatin이 함유된 배지에 엽절편을 배양하였을 때는 kanamycin sulfate의 농도가 증가할수록 줄기 유발수가 감소하는 것을 볼 수 있었으며, 적정선발농도는 10 mg/L이었다. 엽절편은 공동배양 시간에 따라서 생존율과 줄기재분화에 매우 큰 영향을 미쳤다. 엽절편의 생존율은 dipping할 경우가 가장 좋았으며, 배양시간이 길수록 엽절편의 백색화가 관찰되었고, 생존율이 급격히 감소하는 것을 볼 수 있었다. 줄기재분확에 가장 적합한 공동배양 시간은 24시간으로 나타났다. 공시균주와 24시간 동안 공동배양한 엽절편을 10mg/L의 kanamycin sulfate와 2.0 mg/L zeatin이 함유된 줄기 유도배지에 배양한 결과, 105개의 엽절편 중 80개의 엽절편이 생존하였으며, 그 중에서 15개의 재분화된 줄기를 얻었다. 재분화된 줄기들은 형질전환여부를 판명하기 위해 1차적으로 10 mg/L kanamycin sulfate가 함유된 배지에 옮겨 4 주간 배양한 결과, 항생제에 대해서 저항성을 가진 5개의 식물체를 선발할 수 있었다. 2차적으로 rolC유전자와 NPTII 유전자 도입의 유무를 검증하기 위하여 Southern 분석을 행한 결과, 구기자의 형질전환 식물체에서 rolC 유전자 probe의 coding sequence와 동일한 것으로 생각되는 1kb위치와 NPTII probe의 coding sequence와 동일한 것으로 생각되는 2.6kb 위치에서 각각의 밴드를 확인할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제40권4호
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• pp.192-197
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• 2013

환경위해성평가 연구 대상인 형질전환 이벤트로서의 자격을 확인하고자 형질전환세대($T_0V_0$)에서와 같이 영양번식 제1세대($T_0V_1$)에서도 도입유전자 LeLs-antisense의 발현 특성인 무측지성을 유지한 국화 무측지성 형질전환계통 LeLs80의 영양번식 제2세대($T_0V_2$)의 형태적 및 분자 생물학적 특성을 조사하였다. LeLs80 계통의 $T_0V_2$에서도 LeLs-antisense 유전자의 발현 특성인 무측지성이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, Southern 및 Northern 분석에 의해 LeLs-antisense 유전자가 3 copy 도입되었으며, LeLs-antisense 유전자의 전사체가 정상적으로 발현되는 것도 확인할 수 있었다. 또한 flanking T-DNA sequencing method를 이용하여 LeLs-antisense 유전자의 주변 염기서열 분석 통해 LeLs80 계통의 genome내 LeLs-antisense 유전자 주변에 186 ~ 464 bp의 pCAMBIA2300 T-DNA right border 부근으로 추정되는 염기서열이 확인되었고, pCAMBIA2300 전 염기서열과의 비교 분석한 결과, pCAMBIA2300 T-DNA left border와 right border내 선발마커 유전자 NPT II의 발현 promoter 부분과 LeLs-antisense 유전자 발현 terminator 일부 염기서열과 일치하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권2호
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• pp.85-92
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• 2002

Agrobacterium을 이용한 벼의 효율적인 형질전환을 위하여 몇 가지 형질전환 조건을 조사하였다. 그리고 조사된 최적의 형질전환 방법을 이용하여 내한성에 관련된 GPAT 유전자를 식물에 도입하였다. 형질전환 조건은 GUS 발현을 통하여 조사되었다. 본 실험에서는 벼 (Oryza sativa L. cv. Dongjin)의 성숙 종자 유래 캘러스를 3일간 전배양한 후 Agrobacterium을 접종하였다. 접종이 끝난 캘러스는 50mg/L CaCl$_2$, 30mg/L acetosyringone, 2 mg/L 2,4-D, 120 mg/L betaine이 첨가된 공동배양 배지 위에서 암조건으로 10일간 공동배양하여 높은 GUS 발현을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 방법으로 GPAT 유전자를 식물에 도입한 결과 54%의 높은 형질전환율을 나타내었다. 형질전환 식물체를 southern 분석한 결과 wild type 식물체에서는 GPAT 유전자가 검출되지 않았으나, 형질전환 식물체에서는 GPAT 유전자가 검출되었다. 또한 GPAT 유전자로 형질전환된 5 계통의 T1 세대에서 hygromycin에 대한 저항성과 감수성의 유전비율이 3 : 1로 분리되었다. 따라서 본 실험의 결과에서 검토된 고빈도의 형질전환 시스템은 단자엽식물의 형질전환에 있어서 모델계로 이용될 수 있으리라 기대된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권2호
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• pp.93-98
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• 2002

바이러스 설사병의 원인인 VP6유전자를 감자에 형질전환 시키기 위하여 CaMV 35S promoter와 kanamycin 항생제 내성을 갖는 식물발현벡터 pMBP-1에 subcloning하고, 이 재조합 벡터를 A. tumefaciens LBA4404에 도입시킨 후, freeze haw방법을 이용하여 감자에 형질전환 시켰다. 공동배양된 감자의 잎절편은 2,4-D가 2.0 mg/L첨가된 배지에서 2일간 배양 후, 0.01 mg/L NAA, 0.1 mg/L GA$_3$, 2.0 mg/L Zeatin, 100.0 mg/L kanamycin, 500.0 mg/L carbenicillin이 첨가된 선발배지에서 재분화시켰다. 이 때 유도된 신초는 100.0 mg/L의 kanamycin이 포함된 배지에 옮겨준 후, 왕성한 생육을 위해 MS 기본배지에서 다시 배양하였다. 기내배양시 외부유전자의 도입에 의한 외형적인 변화는 찾을 수 없었으며, 형질전환체는 NPT primer를 사용한 PCR방법으로 1차선별 하였다. DIG 표지된 probe를 이용하여 total RNA를 분석한 결과 개체별로 발현양의 차이는 있었으나, 95% 이상의 안정성을 보였고, genomic DNA를 추출해 Southern blot hybridization했을 경우 1~3개의 copy수를 보임으로써 형질전환 식물체에 외래유전자인 VP6유전자가 안정적으로 도입되었음이 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권1호
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• pp.102-109
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• 2010

Fructan은 식물이 저온에 노출 되었을 때 다양한 조직에 축적됨으로써 여러 스트레스에 저항을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 fructan 생합성 경로에 관여하는 효소인 1-sst와 1-fft 유전자를 돼지감자 구근으로 부터 분리하였다. 분리한 1-sst와 1-fft 유전자는 Ti-plasmid vector인 KJG V-B2 vector에 35S promoter에 의해 발현할 수 있도록 형질전환용 벡터를 구축하였다. Agrobacterium tumefaciens법에 의해 1-sst와 1-fft 유전자의 형질전환 벼를 육성하였고, 1-sst, 1-fft 및 HPT 유전자 특이적인 primer를 사용하여 PCR 분석한 결과 유전자가 벼의 callus 게놈내에 안정적으로 삽입되었음을 확인하였다. 또한 Southern 및 RT-PCR 분석에서도 같은 결과를 얻었다. 형질전환 벼의 후대에서도 안정적으로 유전자가 발현되는 homo 계통을 선발하였고 이를 이용해 1-sst와 1-fft 유전자의 삽입이 확인된 형질전환 벼에서 유전자의 발현양상을 알아보기 위해 RT-PCR 및 Real-Time PCR를 수행한 결과 형질전환 벼에서 1-sst와 1-fft 유전자 모두 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 또한 1-sst와 1-fft 유전자가 삽입된 형질전환 벼를 이용한 기능 분석 연구를 통해 식물체가 저온에 노출되었을 때 1-sst와 1-fft의 작용에 의해 fructan 생합성량이 증가됨을 알 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 얻어진 fructan 생합성 관련 유전자가 삽입된 형질전환 벼는 탄수화물대사 및 저온, 건조 등의 환경 stress에 대한 내성에 대해 좋은 육종 소재로 이용 가능할 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제22권12호
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• pp.1614-1620
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• 2012

유전자총(Particle bombardment) 방법에 의해 snowdrop lectin (Galanthus nivalis agglutinin; GNA) 유전자가 도입된 해충저항성 형질전환 벼를 개발하였다. GNA 유전자가 도입된 많은 형질전환 식물체가 재분화되었으며, 형질전환 벼의 GNA 유전자의 integration, expression 및 inheritance는 Southern 및 western analysis분석 방법에 의해 증명되었다. 벼 genome 내 도입 유전자 수는 one 혹은 five copies이었다. 형질전환 $R_1$과 $R_2$ 식물체의 GNA 단백질 발현 분석 결과, 함량은 총 단백질 중 0.01%부터 2.0%까지 포함하고 있었다. 형질전환 식물체 중 GNA 과발현 형질전환 벼를 이용한 생물 검정 결과, 대조구와 비교하여 벼의 주요 해충인 벼멸구(Nilaparvata lugens St${\aa}$l)에 저항성을 나타내었다. 위의 실험 결과를 통해, 해충저항성 유전자인 GNA가 도입된 형질전환 벼는 해충의 증식을 억제하는데 이용될 수 있을 것이다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권4호
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• pp.283-288
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• 1998

비선택성 제초제인 bialaphos는 고등식물에 있어서 glutamine 합성을 억제 하여 식물체를 고사시킨다. Acetyltransferase에 의해 encoding된 bialaphos저항성 유전자는 세균 Streptomyces hygroscopicus SF1239로부터 cloning된것을 사용하였다. Bialaphose 저항성 유전자를 Agrobacterium 감염법을 이용하여 국내에서 재배되는 벼(동진)에 도입한 결과 약30%정도의 형질전환 식물체를 얻을 수 있었다. $\textrm{T}_{1}$ 세대의 17개체는 hygromycin과 bialaphos에 대한 저항성 유전형질이 3:1로 분리되었다. 또한 Southern 분석을 실시한 결과 wild type의 식물체에서는 Bar 유전자의 검출을 볼 수 없었으나 형질전환 식물체의 경우 Bar 유전자의 검출이 가능하였다. $\textrm{T}_{3}$세대의 형질전찬 식물체와 wild type의 식물체를 포장상태에서 비선택성 제초제인 바스타를 살포하고 3주 후에 관찰한 결과 형질전환 식물체는 외형적으로 아무런 피해를 받지 않고 정상적으로 생장하였으나, wild type의 식물체와 잡초는 모두 고사하였다. 이상의 결과를 종합해보면 hygromycin과 bialaphos 저항성 유전자는 Agrobacterium감염법을 이용하여 단자엽 식물인 벼에 도입할 수 있다는 것을 보여준 것이며, 또한 bialaphos 저항성 유전자가 식물에 도입됨으로써 비선택성 제초제에 대한 저항성 식물을 개발 할 수 있다는 것을 보여 주었다.

• 한국육종학회지
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• 제41권4호
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• pp.482-487
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• 2009

사과 대목 M.26은 준왜성대목으로 뿌리의 토양 지지력이 약해 지주 재배를 해야 하는 단점이 있다. 발근력이 향상된 M.26 왜성 대목 형질전환체를 육성하기 위하여 rolC 유전자 전환을 실시하였다. 항생제가 첨가된 재분화 선발 배지에서 재분화된 M.26 신초 1개체의 genomic DNA를 추출하여 PCR과 Southern 분석을 실시한 결과 유전자의 도입을 확인할 수 있었다. 유전자 도입이 확인된 형질전환체의 기내 발근 상태에서의 식물체 특성을 조사한 결과 대조구에 비해 신초 길이가 감소되었고 발근력이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 격리 온실에서 생육시켰을 때 rolC 유전자 고유 특성 중 하나인 분지가 발생되었고, 실생 대목에 접목한 후 묻어떼기를 통한 발근력을 조사한 결과 발근이 현저히 향상되었음을 확인할 수 있었다. 이상에서 확인된 rolC 유전자의 도입에 의한 M.26 사과 대목의 발근력 향상과 동시에 왜화 효과를 검정하기 위해서는 실제 품종과의 접목을 통해서 기존 대목과의 왜화도 차이를 비교할 필요가 있다고 판단되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제5권3호
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• pp.163-168
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• 2003

A routine system based on particle bombardment of embryogenic callus for recovery of fertile transgenic rice (Oryza sativa L.) plants was developed. Embryogenic callus was established within 2-3 months from calli derived from mature seeds of Korean rice cultivar, Nagdongbyeo. The callus was bombarded with the plasmid pRQ6 containing the $\beta$-glucuronidase gene (gusA) and hygromycin phosphotransferase gene (hph, conferring resistance to hygromycin B), both driven by CaMV 35S promoter. Placement of cells on an osmoticum-containing medium (0.2 M sorbitol and 0.2 M mannitol) 4 hrs prior to and 16 hrs after bombardment resulted in a statistically significant increase with 3.2-fold in transient expression frequency gusA. In five independent experiments, the average frequency of transformation showing GUS activities was $8.86\%$. A large number of morphologically normal, fertile transgenic rice plants were obtained. Integration of foreign gene into the genome of $R_0$ transgenic plants was confirmed by Southern blot analysis. GUS and HPT were detected in $R_1$ progeny and Mendelian segregation of these genes was observed in $R_1$ progeny.