• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권3호
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• pp.182-188
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• 2008

내열성 Trehalose synthase를 생산하는 초고온성 균주 HJ6은 일본 Arima 온천수에서 분리하였다. 세포의 길이는 $2{\sim}4\;um$, 직경 0.4 um의 간균으로 생육최적 pH와 온도는 각각 6.5와 $80^{\circ}C$이였다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석하고 계통학적으로 분류한 결과, HJ6 균주는 Thermus thermophilus에 속하는 것으로 동정되었다. PCR법을 이용하여 trehalose synthase(TS) 유전자를 클로닝하고 염기서열을 분석한 결과, ORF는 2,898개의 뉴클레오타이드로 구성되고 915개의 아미노산을 암호화하였다. 아마노산 서열을 바탕으로 상동성을 분석한 결과, Thermus caldophilus GK24 유래 TS와 99%, Meiothermus ruber 유래 TS와 83%의 identity를 나타내었다. 이 유전자를 온도감수성 프로모터를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하며 대장군에서 발현하고 정제하여 약 110 kDa 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 효소는 트레할로스 전환활성에 대한 최적 pH가 7.5이고, 최적온도는 $80^{\circ}C$이며, 활성의 반감기는 $90^{\circ}C$에서 40분으로 확인되어 높은 내열성을 가지는 것으로 확인되었다. 본 효소의 트레할로스 최대 전환율은 기질농도 500mM에서 55.7%를 나타내었고, 기질 농도가 증가함에 따라 더불어 증가하였기 때문에 본 효소의 트레할로스 전환율을 기질농도에 의존적인 것으로 생각되었다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2005년도 생물공학의 동향(XVI)
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• pp.327-333
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• 2005

Dihydroxy-acid dehydratase (DHAD, 2,3-dihydroxy-acid hydrolyase, EC 4.2.1.9) is one of the key enzymes involved in the biosynthetic pathway of the branched chain amino acid isoleucine and valine. Although the enzyme have been purified and characterized in various mesophiles including bacteria and eukarya, the biochemical properties of DHAD has bee not yet reported from hyperthermophilic archaea. In this study, we cloned, expressed, and purified a DHAD homologue from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus P2, which grows optimally at $80\;^{\circ}C$ and pH 3, in E. coli. Characterization of the recombinant S. solfataricus DHAD (rSso_DHAD) revealed that it is the dimeric protein with a subunit molecular weight of 64,000 Da in native structure. rDHAD showed the highest activity toward 2,3-dihydroxyisovaleric acid among 17 aldonic acid substrates Interestingly, this enzyme also displayed 50 % activities toward some pentonic acids and hexonic acids when compared with the activity of this enzyme to the natural substrate. Moreover, rSso_DHAD indicated relatively higher activity toward D-gluconate than any other hexonic acids tested in substrates. $K_m$ and $V_{max}$ values of rSso_DHAD were calculated as $0.54\;{\pm}\;0.04\;mM$ toward 2,3dihydroxyisovalerate and $2.42\;{\pm}\;0.19\;mM$ toward D-gluconate, and as $21.6\;{\pm}\;0.4\;U/mg$ toward 2,3-dihydroxyisovalerate and $13.8\;{\pm}\;0.4\;U/mg$ toward D-gluconate, respectively. In the study for biochemical properties, the enzyme shows maximal activity between $70^{\circ}C$ and $80^{\circ}C$, and the pH range of pH 7.5 to 8.5. The half life time at $80^{\circ}C$ was 30 min. A divalent metal ion, $Mn^{2+}$, was only powerful activators, whereas other metal ions made the enzyme activity reduced. $Hg^{2+}$, organic mercury, and EDTA also strongly inhibited enzyme activities. Particularly, the rSso_DHAD activity was very stable under aerobic condition although the counterparts reported from mesophiles had been deactivated by oxygen.

• 대한소아치과학회지
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• 제33권4호
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• pp.587-596
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• 2006

치아우식증의 원인균으로 알려져 있는 Streptococcus mutans의 여러 균주 중 GS-5균주는 AgI/II 유전자 내에 생기는 nonsense mutation에 의하여 절편의 분비형 AgI/II 단백질을 발현한다. 이러한 사실은 S. nutans GS-5가 독특한 임상 기능을 가질 수 있음을 암시하며, 최근의 보고는 임상적으로 분리된 S. mutans 균주를 이용한 실험 결과에 근거하여 이러한 가능성을 지지한다. 본 연구는 이전의 실험을 통하여 S. mutans의 agI/II 유전자를 확보한 후 재조합 단백질인 N-terminal AgI/II 단백질을 생산하였다. 이 후 하이브리도마를 통하여 1C11A라 명명되는 세포막 단백질 AgI/II에 대한 단항체를 생산하였으며, Western blot과 ELISA를 통하여 이 항체가 AgI/II 단백질에 매우 높은 특이성을 나타냄을 알 수 있었다. 새로이 얻어진 단항체는 AgI/II와 관련된 질환의 기전을 규명하는데 기초 재료가 될 것이다.

• BMB Reports
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• 제40권6호
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• pp.911-920
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• 2007

Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, continues to be one of the leading infectious diseases to humans. It is urgent to discover novel drug targets for the development of antitubercular agents. The 2-C-methyl-Derythritol-4-phosphate (MEP) pathway for isoprenoid biosynthesis has been considered as an attractive target for the discovery of novel antibiotics for its essentiality in bacteria and absence in mammals. MEP cytidyltransferase (IspD), the third-step enzyme of the pathway, catalyzes MEP and CTP to form 4-diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol (CDP-ME) and PPi. In the work, ispD gene from M. tuberculosis H37Rv (MtIspD) was cloned and expressed. With N-terminal fusion of a histidine-tagged sequence, MtIspD could be purified to homogeneity by one-step nickel affinity chromatography. MtIspD exists as a homodimer with an apparent molecular mass of 52 kDa. Enzyme property analysis revealed that MtIspD has high specificity for pyrimidine bases and narrow divalent cation requirements, with maximal activity found in the presence of CTP and $Mg^{2+}$. The turnover number of MtIspD is $3.4 s^{-1}$. The Km for MEP and CTP are 43 and $92{\mu}M$, respectively. Furthermore, MtIspD shows thermal instable above $50^{\circ}C$. Circular dichroism spectra revealed that the alteration of tertiary conformation is closely related with sharp loss of enzyme activity at higher temperature. This study is expected to help better understand the features of IspD and provide useful information for the development of novel antibiotics to treat M. tuberculosis.

• 생명과학회지
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• 제28권4호
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• pp.496-507
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• 2018

톡소이드는 독성은 제거되고 항원성은 유지시킨 독소 단백질로써, 다양한 병원체의 감염 및 질병 예방을 위해 지속적으로 연구 되었다. 그러나, 톡소이드의 활성 감소 및 이와 함께 사용하는 어쥬번트의 부작용 등이 지속적으로 보고되면서, 면역성은 강화하고 어쥬번트의 사용은 줄일 수 있는 톡소이드 항원 전달 시스템이 필요하게 되었다. 따라서, 이러한 단점을 개선하고자 최근 새로운 백신과 약물 전달수송을 위해 다양한 분야에서 활용하고 있는 마이크로/나노 운반체를 톡소이드 항원에 도입하고 있다. 이와 같은 마이크로/나노 운반체는 미생물 자체를 이용하거나 미생물을 통해 생산해 낼 수도 있으며, 더 나아가 다양한 소재의 폴리머를 이용하여 제작할 수 있다. 본 총설에서는 톡소이드 항원 전달을 위한 마이크로/나노 운반체를 미생물 유래의 ghost cells (GCs), 그람 음성 세균이 분비하는 outer membrane vesicles (OMVs) 및 고분자 폴리머로 구성된 nanoparticles (NPs)으로 분류하였다. 마지막으로 각 운반체에 대한 톡소이드 항원의 전달 방식 및 이를 적용하였을 때 일어나는 면역반응에 대하여 서술하였으며, 이를 통해 향후 톡소이드의 효율 및 부작용이 개선되기를 기대한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권11호
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• pp.1971-1982
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• 2017

Piliated Lactobacillus rhamnosus (pLR) strains possess higher adherent capacity than non-piliated strains. The objective of this study was to isolate and characterize probiotic pLR strains in human fecal samples. To this end, mouse polyclonal antiserum (anti-SpaA) against the recombinant pilus protein (SpaA) of L. rhamnosus strain GG (LGG) was prepared and tested for its reactivity and specificity. With the anti-SpaA, a method combining the de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) agar plating separation and colony immunoblotting (CIB) was developed to isolate pLR from 124 human fecal samples. The genetic and phenotypic characteristics of the resultant pLR isolates were compared by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting, and examination of adhesion to Caco-2 cells, hydrophobicity, autoaggregation, and in vitro gastrointestinal tolerance. Anti-SpaA specifically reacted with three pLR strains of 25 test strains, as assessed by western blotting, immunofluorescence flow cytometry, and immunoelectron microscopy (IEM) assays. The optimized MRS agar separation plus anti-SpaA-based CIB procedure could quantitatively detect $2.5{\times}10^3CFU/ml$ of pLR colonies spiked in $10^6CFU/ml$ of background bacteria. Eight pLR strains were identified in 124 human fecal samples, and were confirmed by 16S RNA gene sequencing and IEM identification. RAPD fingerprinting of the pLR strains revealed seven different patterns, of which only two isolates from infants showed the same RAPD profiles with LGG. Strain PLR06 was obtained with high adhesion and autoaggregation activities, hydrophobicity, and gastrointestinal tolerance. Anti-SpaA-based CIB is a rapid and inexpensive method for the preliminary screening of novel adherent L. rhamnosus strains for commercial purposes.

• 생명과학회지
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• 제18권6호
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• pp.878-883
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• 2008

생물비료의 개발을 위하여 분리된 난용성 인산염의 가용화능이 우수한 균주인 Aeromonas hydrophila DA33의 분자육종을 위해 인산가용화 관련 유전자를 도입하였다. E. coli의 gdh 유전자를 도입한 A. hydrophila DA33은 GDH 활성이 증가하여 유전자가 발현됨을 확인하였으며, wild type에 비해 GDH 활성이 약 40% 정도 높게 나타났으며, 이는 도입된 gdh 유전자의 발현에 의한 것으로 보여 진다. 이 균주는 인산가용화에 기여하는 유기산인 gluconate의 생성도 증가하였다. A. hydrophila DA33의 wild type과 gdh 유전자를 도입한 A. hydrophila pGHS/DA33의 난용성 인산염 가용화능을 실험한 결과, gdh 유전자를 도입한 균주의 인산 가용화능이 약 1.4배 정도의 효과를 보였다. 지금까지의 결과로 비춰볼때 앞으로 생물 비료로서의 A. hydrophila DA33 이용 가능성을 나타내며, 분자육종균 A. hydrophila pGHS/DA33은 생물비료로서의 효율성을 가질 것으로 기대된다.

• 미생물학회지
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• 제52권3호
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• pp.336-343
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• 2016

두 종류의 mannanases를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43로부터 mannanase 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. Mannanase 유전자는 manB로 명명되었으며, 427 아미노 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,284개 염기로 구성되었다. ManB는 추론된 아미노산 배열에 근거해서 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 함께 2개의 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. Cellulosimicrobium sp. YB-43의 manB 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 정제된 ManB의 아미노 말단 배열이 QGASAASDG로 결정되었으며 이는 SignalP4.1 server로 그람 음성균을 기준으로 예측된 signal peptide의 결과와 정확하기 일치하였다. 정제된 ManB의 최적 반응조건은 $55^{\circ}C$와 pH 6.5-7.0이며 locust bean gum (LBG), konjac과 guar gum을 가수분해 하였으며, 셀룰로스, 자일란, 전분과 para-nitrophenyl-${\beta}$-mannopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. ManB의 활성은 $Mg^{2+}$, $K^+$와 $Na^+$에 의해 약간 저해되었으며 $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Mn^{2+}$과 SDS에 의해서는 크게 저해되었다. 또한 이 효소는 mannobiose 보다 큰 중합도를 갖는 만노올리고당을 가수분해하였으며, LBG와 만노올리고당을 가수분해하였을 때 mannobiose가 가장 많은 양으로 생성되었다.

• 생명과학회지
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• 제26권10호
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• pp.1113-1120
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• 2016

우리나라의 전통 발효 된장으로부터 균체외 효소로 mannanase를 생산하는 세균 2주가 분리되었다. 분리균 WL-6과 WL-11은 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rDNA의 염기서열에 따라 Bacillus subtilis로 확인되었다. 이들 두 균주로부터 각각 mannanase 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 동일하게 이루어졌다. WL-6과 WL-11 mannanase (Man6, Man11)의 아미노산 잔기 배열은 서로 8개 잔기가 다르며 GH family 26에 속하는 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. Man6과 Man11의 아미노 말단의 26개 아미노 잔기가 signal peptide로 예측되었다. 재조합 대장균로부터 각각 생산된 Man6과 Man11은 94~95% 정도가 균체내에 존재하였고, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당과 locust bean gum을 유사하게 분해하여 주된 반응산물로 mannobiose와 mannotriose를 생성하였다. Man6는 55℃와 pH 6.0, Man11은 60℃와 pH 5.5에서 각각 최대 반응활성을 보였으며, Man11이 Man6에 비해 열안정성이 높았다.

• 미생물학회지
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• 제41권1호
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• pp.1-7
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• 2005

Methylophaga aminosulfidovorans SK1 (KCTC 10323 BP)은 단일 탄소원, 질소원 그리고 에너지원으로 난분해성 화합물인 트리메틸아민을 이용할 수 있다. M. aminosulfidovorans SK1는 진핵세포의 flavin-containing monooxygenase와 유사한 유전자(bFMO)를 지니고 있으며 대장균에서 발현된 재조합 단백질은 강력한 트리메틸아민 산화활성을 보인다. 본 연구에서는 bEMO의 기능과 조절 메커니즘을 연구하기 위하여 bfmo의 상단부 및 하단부 유전자의 염기서열을 결정하였다. bfmo 상단부의 세 개의 열린해독틀은 잘 보존된 nitrate/nitrite response regulators와 methyl accepting protein 유사단백질을 암호화하였다. 하단부의 두 개의 작은 열린해독틀은 기능은 알려져 있지 않지만 진정세균계에서 잘 보존된 단백질의 일종으로 나타났다. 역전사효소 중합효소증폭반응을 통하여 여섯 개의 유전자는 세 개의 독립된 오페론으로 구성되어 있음을 확인하였다. bfmo의 상단부에 위치하는 세 개의 조절유전자는 두 개의 프로모터에서 전사되었다. 그리고 이와 독립적으로 bfmo와 두 개의 하단부 유전자가 하나의 전사단위를 이루고 있다.