• 농업생명과학연구
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• 제45권6호
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• pp.201-212
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• 2011

인천 연안의 심하게 오염된 갯벌로부터 강력한 세포외 알카리성 단백질 분해효소를 생산하는 호알카리성 Bacillus clausii I-52를 분리하였으며, 이 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소의 유전자를 cloning하여 서열 분석을 하였다. Chromosome 서열이 완전히 밝혀진 Bacillus subtilis의 서열을 기초로 하여 알카리성 단백질 분해효소 및 promoter를 포함하도록 primer를 고안하여 PCR을 수행하여 2,277 bp의 DNA 단편을 얻었으며 BLAST 분석 결과 29 개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 77 개의 아미노산으로 이루어진 propeptide 및 275 개의 아미노산을 갖는 활성형의 BCAP으로 구성된 총 381 개의 아미노산을 코딩하는 1,143 bp의 open reading frame을 확인하였다. 활성형 BCAP의 N-말단 아미노산은 Ala이며, 분자량 및 pI 값은 각각 27698.7 Da과 6.30으로 계산되었다. 아미노산 상동성을 분석한 결과, B. subtilis 유래의 nattokinase precursor 및 B. subtilis BSn5 유래의 subtilisin E precursor와 99%의 서열 상동성을 나타내어 B. clausii I-52 유래의 BCAP은 subtilisin 계열의 단백질 분해효소임을 확인하였다. E. coli BL21(DE3)에서 발현한 재조합 BCAP는 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 를 효율적으로 분해하였다. Refolding한 재조합 BCAP은 전형적인 serine protease inhibitor인 PMSF에 의하여 강하게 효소 활성이 억제됨으로써 serine protease 계열의 단백질 분해효소임을 알 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제2권3호
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• pp.166-173
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• 1992

The expression of Bacillus subtilis $\alpha$-amylase from the phoA-amyE fusion gene in recombinant E. coli was investigated under various environmental conditions. The overexpression of cloned $\alpha$-amylase caused retardations in cell growth and synthesis of alkaline phosphatase (AP) from the chromosomal phoA gene. The change of culture temperature from $37^\circ{C}$ to $30^\circ{C}$ increased the specific activities of both $\alpha$-amylase and $\beta$-lactamase by six and two times, respectively, whereas the AP activity remained unchanged. The experiments with chlorampenicol (a translation inhibitor) suggested the enhancement of $\alpha$-amylase activity at $30^\circ{C}$, and this was partly due to the stability of $\alpha$-amylase itself. The further decrease of the temperature to $25^\circ{C}$ slowed down both the cell growth and cloned-gene expression rate. The $\alpha$-amylase activity showed a maximum at pH of 7.4 while alkaline phosphatase was most effectively produced at pH of 8.3.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권2호
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• pp.122-129
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• 1998

최근 생물방제균으로 주목받고 있는 Enterobacter cloacae의 방제기작이 이 균에 의해 토양내에서 생산된 휘발성 ammonia이며 ammonia의 생산에는urease가 관계한다는 보고를 근거로 하여, 항생물질 생산성 균주로 선발된 우수한 길항균주에 암모니아 생성능, 즉 urease 유전자를 유전적으로 부가함으로써 항진균성 길항물질 생산과 암모니아 생산이 동시에 이루어 질 수 있는 새로운 다기능의 생물방제균을 유전적으로 육종하고자 하였다. 저병해 인삼경작지로부터 식물근부균 Fusarium solani의 생육을 강하게 억제하는 길항세균 한 균주 SH14균주를 분리, 선발하였으며, 분리된 균주를 동정한 결과 Bacillus subtilis이거나 그 근연종으로 추정되었다. 억제기작 실험을 통해 길항균주 B. subtilis SH14에 의해 생산되는 항진균성 길항물질은 외막가수분해효소와 같은 고분자 물질이 아니라 열에 안정한 저분자의 항생물질임을 알 수 있었다. 한편 ammonia 생산을 위한 urease의 유전자는 urease 생산력이 강력한 호알칼리성 Bacillus pasteurii의 urease 생산유전자를 E. coli-Bacillus shuttle vector인 pEB203에 subcloning하였고, 이어서 pGU 366으로 명명된 이 recombinant plasmid를 선발된 항진균성 길항균주 B. subtilis SH14에 PEG-induced protoplast transformation 방법으로 도입, 발현시켰으며, 최적조건을 조사하여 90분간의 lysozyme 처리과정 후 1.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 DNA와 40% PEG4000의 첨가로 약 6.5$\times$$10^{-4}$의 형질전환율을 얻을 수 있었다. 아울러 암모니아 생성능이 부가된 생물방제균 B. subtilis SH14(pGU366)에 의해 식물근부균 F. solani에 대한 생육억제력이 증가되는지 여부를 억제거리 측정법과 균체중량법을 통해 확인한 결과 urease 유전자가 도입된 형질전환체 B. subtilis SH14(pGU366)의 근부균 생육억제능이 각각 36.7%, 44.0%정도로 숙주균주인 B. subtilis SH14에 비해 근부균 생육억제능을 보다 강하게 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 항진균성 항생물질 생산성 생물방제균 B. subtilis SH14에 외부의 urease유전자를 도입하여 ammonia 생성능을 부가함으로써 생물방제력의 상승효과를 거둘 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제46권2호
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• pp.207-212
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• 2010

전통 발효식품인 된장으로부터 mannanase의 생산균으로 분리된 WL-8 균주는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA의 염기서열에 근거하여 Bacillus subtilis로 동정되었다. B. subtilis WL-8은 locust bean gum 보다는 밀기울이 첨가된 LB 배지에서 mannanase 생산성이 높았으며, 24시간 배양하였을 때 약 20 U/ml에 이르렀다. 분리균 WL-8의 mannanase 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 WL-8의 mannanase는 GH family 26에 속하며 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. B. subtilis WL-8의 mannanase 유전자를 함유한 재조합 대장균의 배양상등액과 균체파쇄상등액을 사용하여 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였으며, $60^{\circ}C$보다 높은 온도에서 배양상등액보다는 균체파쇄상등액에 존재하는 mannanase가 더 높은 활성을 보였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권3호
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• pp.331-338
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• 2012

A novel gene coding for an endo-${\beta}$-1,4-mannanase (manA) from Bacillus subtilis strain G1 was cloned and overexpressed in P. pastoris GS115, and the enzyme was purified and characterized. The manA gene consisted of an open reading frame of 1,092 nucleotides, encoding a 364-aa protein, with a predicted molecular mass of 41 kDa. The ${\beta}$-mannanase showed an identity of 90.2-92.9% ${\leq}95%$) with the corresponding amino acid sequences from B. subtilis strains deposited in GenBank. The purified ${\beta}$-mannanase was a monomeric protein on SDS-PAGE with a specific activity of 2,718 U/mg and identified by MALDI-TOF mass spectrometry. The recombinant ${\beta}$-mannanase had an optimum temperature of $45^{\circ}C$ and optimum pH of 6.5. The enzyme was stable at temperatures up to $50^{\circ}C$ (for 8 h) and in the pH range of 5-9. EDTA and most tested metal ions showed a slightly to an obviously inhibitory effect on enzyme activity, whereas metal ions ($Hg^{2+}$, $Pb^{2+}$, and $Co^{2+}$) substantially inhibited the recombinant ${\beta}$-mannanase. The chemical additives including detergents (Triton X-100, Tween 20, and SDS) and organic solvents (methanol, ethanol, n-butanol, and acetone) decreased the enzyme activity, and especially no enzyme activity was observed by addition of SDS at the concentrations of 0.25-1.0% (w/v) or n-butanol at the concentrations of 20-30% (v/v). These results suggested that the ${\beta}$-mannanase expressed in P. pastoris could potentially be used as an additive in the feed for monogastric animals.

• Journal of Microbiology
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• 제44권2호
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• pp.206-216
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• 2006

In this study, we have attempted to characterize the functions of YlaC and YlaD encoded by ylaC and ylaD genes in Bacillus subtilis. The GUS reporter gene, driven by the yla operon promoter, was expressed primarily during the late exponential and early stationary phase, and its expression increased as the result of hydrogen peroxide treatment. Northern and Western blot analyses revealed that the level of ylaC transcripts and YlaC increased as the result of challenge with hydrogen peroxide. A YlaC-overexpressing strain evidenced hydrogen peroxide resistance and a three-fold higher peroxidase activity as compared with a deletion mutant. YlaC-overexpressing and YlaD-disrupted strains evidenced higher sporulation rates than were observed in the YlaC-disrupted and YlaD-overexpressing strains. Analyses of the results of native polyacrylamide gel electrophoresis of recombinant YlaC and YlaD indicated that interaction between YlaC and YlaD was regulated by the redox state of YlaD in vitro. Collectively, the results of this study appear to suggest that YlaC regulated by the YlaD redox state, contribute to oxidative stress resistance in B. subtilis.

• 한국식품과학회지
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• 제30권6호
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• pp.1426-1431
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• 1998

본 연구에서는 재조합 Bacillus subtilis에서 발현된 Streptomyces albus KSM-35유래의 amylase를 정제하고 특성을 구명하였다. 정제된 효소는 SDS-PAGE를 통하여 분자량이 약 50 kD인 것으로 밝혀졌으며, isoelectric focusing을 통하여 측정된 pI값은 약 4.3이었다. 효소의 최적 반응온도는 $45^{\circ}C$이었으며 최적의 pH는 6.0이었다. D-value는 45, $55^{\circ}C$에서 각각 279분, 191분이었고 D-value로부터 계산된 Z-value는 $17.7^{\circ}C$였다. 수용성 전분용액을 기질로 사용한 효소반응의 초기에는 maltotriose, maltopentaose와 maltotetraose가 주로 생성되었지만 시간이 경과함에 따라 이들의 농도는 감소하였고 maltose의 농도가 점차 증가하였다. 이러한 반응 생성물의 분해는 Thin layer chromatography를 통하여 확인할 수 있었다. 기질에 의한 저해가 없다고 가정하고 Michaelis-Menten kinetics를 이용하여 속도상수를 추정하였을 때 최대 반응속도는 0.37 mM/min, Michaelis-Menten 상수는 0.13% (w/v)로 나타났다.

• KSBB Journal
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• 제31권2호
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• pp.105-112
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• 2016

Ferritin is known to regulate iron metabolism and maintain iron in a variety of the eukaryotic organisms. The region encoding the mature ferritin (0.47 kb, H-type) of Periserrula leucophryna was amplified using the designed primers including restriction enzyme site and termination codon and subcloned in frame to the pRBAS secretion vector containing the signal sequence, RBS, and promoter of amylase gene (E. coli-Bacillus shuttle vector), resulting in recombinant pRBAS-PLF vector. Recombinant ferritin (18 kDa) was correctly processed and secreted from Bacillus subtilis LKS strain harboring the pRBAS-PLF vector and quantitatively analyzed by SDS-PAGE and western blot, respectively. Secretion of the ferritin was optimized by culture conditions (host, medium, temperature, nitrogen source) in 3 L batch culture and 5 L jar fermenter. Finally. the ferritin was largely produced using 50 L fermenter as the following conditions; at $30^{\circ}C$, 150 rpm, 1 vvm in Bacillus subtilis LKS using PY medium. The secreted ferritin was maximally measured (approximately 177.6 ug/ml) when the cell density reached to 14.4 at $OD_{600}$ (20 h incubation). The iron binding activity was confirmed by Perls' staining in 7.5% non-denaturing gel, indicating that the multimeric ferritin (composed of 24 subunits) was formed in the culture broth after secretion. Biologically, the culture broth and powder type containing ferritin were tested for possibility as feed additive in chicken broiler. As a result, the ferritin stimulated the growth of chick broil and improved feed efficiency and production index.

• 미생물학회지
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• 제36권3호
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• pp.203-208
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• 2000

재조합 플라스미드 pAL850에 함유된 Bacillus circulans KCTC3004 $\alpha$-amylase 유 전자를 pUB110을 이용하여 shuttle 플라스미드 pALS111을 만들어 Bacillus 세포에 이동. 발현시켰다. Bacillus subtilis(고초균)와 Bacillus megaterium(거대균)으로 형질전환된 pALS111로부터 $\alpha$-amylase는 세포증식과 비례하여 생산되었다. 형질전화주가 생산하는 $\alpha$ -amylase의 최대활성을 유전자 공여 균주인 B. circulans와 비교했을 때 고초균은 약 95배, 거대균은 약 34배 정도의 높은 활성을 나타내었다. 그리고 대장균 형질전환주는 분비율이 10% 정도인데 반하여 고초균 형질전화주는 생산된 효소전부를 , 거대균 형질전환주는 약 98%를 세포외로 분비함을 보임으로써 고초균과 거대균은 실용적인 면에서 대장균보다 우월 함을 나타내었다, pALS111의 각 숙주 내에서의 안정성을 살펴본 결과 거대균에서는 92%, 고초균에서는 76%, 대장균에서는 38% 로 나타났다. SDS-PAGE와 zymogram을 통해 추정 된 대장균과 고초균, 거대균에서 발현된 효소의 분자량은 약 55,000으로 확인되었다. 이들 형질전환주가 생산하는 $\alpha$-amylase는 starch 에 작용하여 주된산물로서 maltotriose 이상의 다양한 maltooligosaccharide들을 생산함이 확인 되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권1호
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• pp.59-62
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• 2008

The peptide methionine sulfoxide reductases (Msrs) are enzymes that catalyze the reduction of methionine sulfoxide back to methionine. Because of two enantiomers of methionine sulfoxide (S and R forms), this reduction reaction is carried out by two structurally unrelated classes of enzymes, MsrA (E.C. 1.8.4.11) and MsrB (E.C. 1.8.4.12). Whereas MsrA has been well characterized structurally and functionally, little information on MsrB is available. The recombinant MsrB from Bacillus subtilis has been purified and crystallized by the hanging-drop vapor-diffusion method, and the functional and structural features of MsrB have been elucidated. The crystals belong to the trigonal space group P3, with unit-cell parameters a=b=136.096, $c=61.918{\AA}$, and diffracted to $2.5{\AA}$ resolution using a synchrotron-radiation source at Pohang Light Source. The asymmetric unit contains six subunits of MsrB with a crystal volume per protein mass $(V_M)\;of\;3.37{\AA}^3\;Da^{-1}$ and a solvent content of 63.5%.