• Fisheries and Aquatic Sciences
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• 제11권4호
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• pp.205-208
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• 2008

The mixotrophic dinoflagellate Cochlodinium polykrikoides was reported to be linked to major fish kills in Korea and Japan since the 1990s. Rapid and sensitive detection of microalgae has been problematic because morphological identification of dinoflagellates requires light microscopic and scanning electron microscopic observations that are time consuming and laborious compared to real-time PCR. To address this issue, a real-time PCR probe targeting the ITS2 rRNA gene was used for rapid detection and quantification of C. polykrikoides. PCR inhibitors in water column samples were removed by dilution of template DNA for elimination of false-negative reactions. A strong association between cell quantification using real-time PCR and microscopic counts suggests that the real-time PCR assay is an alternative method for cell estimation of C. polykrikoides in environment samples.

• 대한임상검사과학회지
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• 제41권4호
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• pp.153-157
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• 2009

The production of extended-spectrum ${\beta}$-lactamases ($ESBL_S$) of the TEM or SHV type by bacterial pathogens is a major threat to the use of the clinically important expanded-spectrum cephalosporins. The characterization of the SHV ESBLs producing Klebsiella pneumoniae strains present in clinical isolates is time-consuming processes. We describe here in the development of a novel system, which consists of a real time PCR. We found 11 K. pneumoniae strains to be presumptive strains ESBLs producers by clinical and laboratory standards institute (CLSI) guidelines. The double disk synergy test showed 8 ESBL positive and conventional PCR showed 10 SHV ESBL positive, which were K. pneumoniae strains isolates. By real time PCR analysis, SHV gene in 11 of 11 strains were identified. When sequencing analysis was compared with real time PCR, both analysis were presented 99% similarity. In this study, we used a rapid, sensitive, and specific real-time PCR (RT-PCR) method for detection of the assay SHV ESBL producing K. pneumoniae strains in clinical isolates.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제48권2호
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• pp.99-103
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• 2010

Malaria is endemic in the Cukurova region while it is sporadic in other regions of Turkey. Therefore, the laboratory and clinical diagnosis of malaria is important for the treatment of malaria. In this study, 92 blood samples that were taken from the suspected malaria patients for routine diagnosis in a period of 10 years between 1999 and 2009 were analyzed. All of these blood samples were examined by microscopic examinations using Giemsa-stained thick blood films, nested PCR, and real-time PCR. The sensitivity-specificity and positive-negative predictive values for these diagnostic tests were then calculated. It was found that the positive predictive values of microscopic examination of thick blood films, nested PCR, and real-time PCR were 47.8%, 56.5%, and 60.9% for malaria, respectively. The real-time PCR was found to have a specificity of 75% and sensitivity of 100%, while specificity and sensitivity of nested PCR was found 81.2% and 97.7% according to the microscopic examination of thick blood films, respectively.

• 한국동물위생학회지
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• 제31권4호
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• pp.485-492
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• 2008

Salmonella enterica serovars Gallinarum(SG, causative agent of fowl typhoid) and S Pullorum(SP, causative agent of pullorum disease) are very important bacterial pathogens in poultry industry. They share some common antigenic properties though the characteristics of outbreaks are quite different. To discriminate between SG and SP, we developed two rapid diagnostic methods, allele-specific real-time PCR and 3'-tailed PCR over 2 single nucleotide polymorphisms ($237^{th}\;and\;598^{th}$). In both methods, $237^{th}$ allele was found to be a good target for differential diagnosis, while $598^{th}$ allele produced some non-specific reactions.

• KSBB Journal
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• 제29권5호
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• pp.361-371
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• 2014

Mycoplasma is well recognized as one of the most prevalent and serious microbial contaminants of biologic manufacturing processes. Conventional methods for mycoplasma testing, direct culture method and indirect indicator cell culture method, are lengthy, costly and less sensitive to noncultivable species. In this report, we describe a new TaqMan probe-based real-time PCR method for rapid and quantitative detection of mycoplasma contamination during manufacture of biologics. Universal mycoplasma primers were used for mycoplasma PCR and mycoplasma DNA was quantified by use of a specific TaqMan probe. Specificity, sensitivity, and robustness of the real-time PCR method was validated according to the European Pharmacopoeia. The validation results met required criteria to justify its use as a replacement for the culture method. The established real-time PCR assay was successfully applied to the detection of mycoplasma from human keratinocyte and mesenchymal stem cell as well as Vero cell lines artificially infected with mycoplasma. The overall results indicated that this rapid, specific, sensitive, and robust assay can be reliably used for quantitative detection of mycoplasma contamination during manufacture of biologics.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.12-20
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• 2008

세포배양 유래 생물의약품 생산 공정에서 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. MVM은 동물 세포주와 동물 세포 배양 공정에 오염되는 대표적인 바이러스이다. 세포배양 유래 생물의약품의 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 real-time PCR 시험법을 확립하였다. MVM에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 MVM DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양 법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 $6{\times}10^{-2}TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포에서 MVM검출 시험을 실시한 결과 MVM을 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 MVM을 정량적으로 검출할 수 있었다. 또한 바이러스 필터 공정에서 MVM제거 효과를 감염역가 시험법과 비교 검증한 결과 더 높은 민감도로 빠른 시간에 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 MVM real-time PCR시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제20권8호
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• pp.1201-1206
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• 2010

현장의 환경 시료를 대상으로 Real-Time PCR법과 LC/MS법을 이용하여 마이크로시스틴 검출방법을 비교 연구하였다. 3종류의 primer쌍을 이용하여 3종의 Microcystis aeruginosa 표준균주를 대상으로 Real-Time PCR법을 실시한 결과 TOX2P/TOX2M primer를 이용한 균주에서만 마이크로시스틴이 검출되었다. 2009년 6~9월 사이에 남조류가 발생한 상수원수 시료를 정립된 Real-Time PCR법과 기존의 LC/MS법으로 실험한 결과 11개 시료 모두에서 마이크로시스틴이 검출되었고, 농도는 5.98~219.0 ${\mu}g/l$ 범위로 조사되었다. 정수처리 공정별 실험에서는 BAC 여과 단계에서 마이크로시스틴이 완전히 제거되는 것으로 나타났다. 실험결과 Real-Time PCR법은 기존의 표준시험방법인 LC/MS법 보다 분석시간을 많이 단축시키는 것으로 나타나 효과적인 마이크로시스틴 검출방법임을 알 수 있었다.

• 식물병연구
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• 제18권4호
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• pp.298-303
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• 2012

토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV)는 온실가루이(Bemisia tabaci)에 의해서 영속전염되는 DNA 바이러스로 토마토에 발생하는 가장 중요한 병 중 하나이다. 우리나라에서 TYLCV는 2008년 최초로 보고된 이래 급속하게 전국적으로 확산되어 토마토 생산에 심각한 경제적 손실을 일으키고 있다. 토마토 생산과정에서 TYLCV의 확산을 최소화하기 위해 바이러스의 조기진단이 매우 중요하다. 본 연구에서는 바이러스의 신속진단을 위해 초고속 정밀 PCR 진단기술을 개발하였으며, 이는 마이크로칩을 기반으로 하여 $5{\mu}l$의 시료만으로 PCR을 수행할 수 있도록 고안된, 휴대가 가능할 정도의 소형 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR 기기를 이용한 새로운 기술이다. 본 연구에서 개발된 초고속 정량 PCR을 이용하였을 때 TYLCV 진단을 위한 30 cycle의 PCR과 용융점분석(melting curve analysis)에 15분 이내의 시간이 소요되었으며, GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR을 이용한 초고속 정밀진단 기술은 향후 TYLCV의 대발생을 모니터링하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구결과는 GenSpector$^{TM}$ TMC-1000 PCR기반의 초고속정량 PCR 기술을 이용한 식물 바이러스의 진단기술 개발로는 최초의 보고이다.

• 한국축산식품학회지
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• 제31권6호
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• pp.851-857
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• 2011

This study was conducted to develop a real time reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) method for the detection of viable Enterobacteriaceae in milk using primers based on the genes of ribosomal proteins S11 and S13 and to determine effects of heating and subsequent treatments on the threshold cycle (Ct) of the real time RT-PCR. Total RNA was isolated from 17 strains of bacteria including 11 strains of Enterobacteriaceae suspended in milk using a modified Tri reagent method. SYBR Green Master Mix was added to the RNA and the mixture was subjected to the real time RT-PCR. The Cts of eleven type strains of the Enterobacteriaceae in milk ($10^7$ cells) in the real time RT-PCR ranged from 21.5 to 24.6. However, the Cts of Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter calcoaceticus, and three gram-positive bacteria were more than 40. The real time RT-PCR detected as low as $10^3$ cells in agarose gel electrophoresis. The Cts increased from 22.0 to 34.2 when milk samples contaminated with Escherichia coli ($10^7$ cells/mL) were heated at $65^{\circ}C$ for 30 min. In addition, subsequent incubation at $37^{\circ}C$ for 6 and 24 h increased the Cts further up to 36.2 and 37.2, respectively. Addition of RNase A to the bacterial suspension obtained from the heated milk and subsequent incubation at $37^{\circ}C$ for 1 h increased the Cts to more than 40. The results of this study suggests that pretreatment of bacterial cells heated in milk with RNase A before RNA extraction might enhance the ability to differentiate between viable and dead bacteria using real time RT-PCR.

• 한국식품과학회지
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• 제43권1호
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• pp.119-123
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• 2011

본 연구에서는 두 종류의 선택배지를 활용한 배지배양법과 realtime PCR의 C. jejuni 검출능력을 비교하였다. 소시지, 쇠고기 분쇄육, 무순에 C. jejuni를 접종하고 Hunt broth로 증균배양 하였으며, mCCD agar와 Preston agar에 배양액을 획선도말하여 미호기적으로 배양하였다. 동시에 증균배양액에서 1 mL을 채취하여 realtime PCR을 실시하였다. 실험결과, real-time PCR은 쇠고기 분쇄육과 소세지에서 두 가지 선택배지와 비교하여 동일한 검출력을 보였으나 무순에서는 훨씬 더 많은 양성을 검출하였다(p<0.05). 두 배지간의 비교에서는 Preston agar와 mCCD agar는 통계학적 유의차가 없는 민감도를 보였다(p>0.05). 결론적으로 real-time PCR은 표준검출법인 배지배양법과 비교하여 동등하거나 우수한 민감도를 지닌 신속검출기법인 것으로 사료되며, 배지배양법에 앞서 선별검사로 사용할 경우 시간, 비용, 노동력 절감에 있어서 매우 유효한 방법이 될 것으로 판단된다.