• 분석과학
• /
• 제24권6호
• /
• pp.510-518
• /
• 2011

최근 질량분석기와 다차원 크로마토그래피 분석법과 대용량 데이터를 처리하는 생물정보학 프로그램 등과 같은 복합적인 기술요소들의 발전은 대량 프로테옴을 분석하는 것을 가능하게 했다. 하지만, 이런 대량의 프로테옴을 분석하는 것은 단백질 절편화 과정의 긴 소요 시간과 낮은 재현성으로 인하여 한계를 가진다. 이 연구에서는 어쿠스틱 기술을 이용해 빠르게 단백질을 분해하는 새로운 방법을 제시했다. 이 어쿠스틱 기술의 시간과 강도를 최적화하기 위해서 여러 가지 조건에서 BSA 단백질을 트립신으로 절편화한 후 액체 크로마토그래피와 질량분석기로 분석하였다. 16시간동안 인큐베이션하는 기존의 방법과 슈퍼 어쿠스틱 기술을 사용한 방법을 비교하였을 때 슈퍼 어쿠스틱 기술이 기존의 방법보다 더 높은 아미노산 동정율을 보였으며, 유방암 세포와 같은 단백질 복합체에 적용하였을 때 30분의 절편화 시간에서도 효율적인 결과를 확인할 수 있었다. 이 새로운 방법은 샘플 전처리 과정에서 많은 양의 단백질일지라도 더 좋은 효율성을 가지게 되고 또한, 소비되는 시간도 줄여주며 일정 시간내의 샘플 처리량도 증가하게 된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
• /
• 제8권1호
• /
• pp.1-9
• /
• 2004

프로테오믹스(proteomics, 단백질체학이라고도 함)의 잠재적 중요성은 간질환, 심장질환, 몇몇 종류의 암 등의 의학, 생식 독성, 발생 독성, 생체 독성 연구 분야에서도 명백하게 제시되었다. 그러나 단백질을 대상으로 연구하여 유전자 기능을 연구하는 프로테오믹스 연구를 각각의 분야에 접목시키려는 노력은 아직까지 빈약하다. 프로테오믹스는 기능을 갖는 단백질들의 발현을 종합적이고 정량적으로 측정하는 가장 직접적인 수단이고, 질병, 약물투여, 쇼크, 내분비계 장애물질 등 생물학적인 동요(perturbation)에 의하여 변하는 단백질들의 발현 양상 변화를 정확하게 관찰할 수 있게 한다. 그리고 생체내 유전자 발현의 궁극적인 양상을 규명할 수 있으며, 또한 유전자, 단백질 및 질병간의 연결고리를 제공한다. 기존의 biomarker는 다른 질병 표지자와 연관성이 높아 직접적인 biomaker와 정확한 연관을 판정하기 어렵다. 따라서 대량 발굴 탐색(high-throughput screening)이 가능한 2차원 전기 영동 분석과 MALDI-TOF또는 protein chip array와 SELDI-TOF에 의한 단백질 분자 구조 분석 기술 및 이들을 지원하는 생물정보학(bioinformatics)의 발전을 이용하여, 생식학 연구에 이용할 수 있는 표적 단백질 발굴 및 정성 정량적 연구에 적절한 이용이 가능할 것이다. 이러한 연구는 생식과정 중 배아 발생 및 조직 기관 발생 중 유전자 발현의 변화, 내분비계 장애물질 등 호르몬 및 독성 물질의 작용 기전, ecotoxicogenomics지표 marker의 변동 분석, 중간대사물질체학(metabolomics)에의 이용 등등의 연구에 필수적인 방법으로 발전할 것이다.

• 생태와환경
• /
• 제36권3호통권104호
• /
• pp.369-374
• /
• 2003

내분비계장애물질 (환경호르몬)의 일종인 노닐페놀(nonylphenol, NP)에 의한 수서 환경 내 생태독성 평가의 일환으로 한국에 서식하는 무당개구리 (Bombina orientalis) 수컷에서 NP에 의한 간조직 내 발현 단백질의 변화를 추적하였다. 체중 10${pm}$0.1g의 수컷 무당개구리에 NP을 10mg/kg 농도로 복강 주사한 후 48 및 96시간 후에 간을 절취 한 뒤 마쇄하여 2차원 전기영동을 수행하였다. Coomassie brilliant blue로 염색한 gel 상에서 전체적으로 50${\sim}$60개 정도의 protein spots을 확인할 수 있었으며 단백질 spots의 변화를 비교 분석한 결과 NP처리 48시간 후 8개의 spots이 증가한 반면 12개의 spots이 감소하였다. 96시간 후에는 30개의 spots이 증가되었고 8개의 spots이 감소하였다. 전체적으로는 약20%정도의 단백질의 변화가 있었다. 단백질 발현의 동태는 투여 후 2일 까지는 단백질 생산이 일시적으로 감소하지만 다시 새로운 단백질을 생성하는 것으로 사료된다. NP 노출에 따른 무당개구리 간조직 내 단백질 발현의 변화는 한국의 수서환경에서 내분비계 장애물질의위해성 평가에 요구되는 단백질 biomaker의 개발에 이용 할 수 있을 것이다.

• Archives of Pharmacal Research
• /
• 제29권3호
• /
• pp.224-234
• /
• 2006

We employed human SK-MEL-28 cells as a model system to identify cellular proteins that accompany N-(4-methyl)phenyl-O-(4-methoxy)phenyl-thionocarbamate (MMTC)-induced apoptosis based on a proteomic approach. Cell viability tests revealed that SK-MEL-28 skin cancer cells underwent more cell death than normal HaCaT cells in a dose-dependent manner after treatment with MMTC. Two-dimensional electrophoresis in conjunction with matrixassisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry analysis or computer matching with a protein database further revealed that the MMTC-induced apoptosis is accompanied by increased levels of caspase-1, checkpoint suppressor-1, caspase-4, NF-kB inhibitor, AP-2, c-Jun-N-terminal kinase, melanoma inhibitor, granzyme K, G1/S specific cyclin D3, cystein rich protein, Ras-related protein Rab-37 or Ras-related protein Rab-13, and reduced levels of EMS (oncogene), ATP synthase, tyrosine-phosphatase, Cdc25c, 14-3-3 protein or specific structure of nuclear receptor. The migration suppressing effect of MMTC on SK-MEL-28 cell was tested. MMTC suppressed the metastasis of SK-MEL-8 cells. It was also identified that MMTC had little angiogenic effect because it did not suppress the proliferation of HUVEC cell line. These results suggest that MMTC is a novel chemotherapeutic and metastatic agents against the SK-MEL-28 human melanoma cell line.

• 분석과학
• /
• 제30권6호
• /
• pp.348-354
• /
• 2017

이 연구는 출산 후 1, 3, 6주가 경과한 산모에서 얻은 모유의 단백체 발현 양상과 과 발현 단백질을 검출하는 것을 목적으로 하였다. 샷 건 정량 단백체 분석법을 이용하여 모유 중의 단백질을 동정하였고, 각 수유단계 간에 정량적 비교를 하였다. 각 주의 모유 샘플은 두 명의 산모로부터 얻어진 모유를 혼합하였고, 각 샘플 마다 3회 반복 실험을 하였다. Casein은 모유 내에 가장 많이 존재하는 단백질로서 실험의 정확성을 위하여 제거하였고, 트립신을 이용한 절편 화로 모유 단백질들을 펩타이드로 변환하였다. 처리된 펩타이드들은 역상 C18 미세관 크로마토그래피 및 이온-트랩 질량분석기를 이용하여 분석하였으며, Spectra Counting으로 단백질의 정량적 비교를 하였다. 각 샘플 당, 80-109 개의 단백질을 중복 제거한 후 동정하였다. 당화 단백질, metabolic enzyme, 및 lactoferrin, Carboxylic ester hydrolase, Clusterin을 포함하는 chaperon 효소들이 주로 검출되었다. 각 반복실험에서 재현성 있게 검출되는 63개의 단백질에 대한 정량적 비교분석 결과 25개의 단백질이 통계적으로 유의하게 수유단계에 따라 변화하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 Ig lambda-7 chain C region과 Tenascin은 시간에 따라 현저하게 감소하였다. 향후 이와 같은 수유 단계에 따른 모유 내 단백의 변화가 생리적으로 가지는 의미에 관하여 추가적인 연구가 필요하다 생각된다.

• 미생물학회지
• /
• 제45권3호
• /
• pp.268-274
• /
• 2009

건강보조식품 등으로 이용되는 Arthrospira platensis는 세계적으로 대량생산되고 있으나 생산공정 중 수확단계에서 많은 비용이 소요된다. 본 연구에서는 부상을 이용한 효과적인 수확을 위해 균주의 개량을 시도하였으며, 개량균주의 생리적 물리적 특성을 파악하고자 하였다. Ethyl methanesulfonate (EMS)를 모균주 A. platensis KCTC AG20590에 0.24%의 농도로 10, 20, 30분씩 처리하여, 형태 및 부상성이 우수한 균주 A. platensis M20CJK3 균주를 분리하였다. A. platensis M20CJK3은 느슨한 형태에서 촘촘한 형태로 세포사(trichome)의 길이 및 코일간 간격이 감소하였으며, 생장 및 $CO_2$ 고정능이 각각 15%, 17% 향상되었다. 또한, 개량균주의 부상성은 모균주에 비해 2배 이상 향상되었다. 이차원 전기영동 분석을 통해 모균주와 개량균주의 단백질 발현양상을 비교분석한 결과 광합성 관련 색소의 구조와 광전자전달계에 관련된 단백질의 발현 양상이 차이를 보였다. 본 연구에서 개발된 A. platensis M20CJK3은 고밀도 대량배양 및 수확에 유리하며, A. platensis 유전자 연구의 유용한 모델 균주로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 미생물학회지
• /
• 제54권4호
• /
• pp.343-353
• /
• 2018

이전 연구에서 우리는 RDX (hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine) 분해세균 Pseudomonas sp. HK-6에서 xenobiotic reductase B를 암호화하는 xenB 유전자의 돌연변이 균주를 이용하여 RDX 스트레스에 대한 xenB 유전자의 역할에 관하여 연구를 보고하였다[Lee et al. (2015) Curr. Microbiol. 70(1): 119-127]. 본 연구에서는 Pseudomonas sp. HK-6 xenA 돌연변이 균주로 연구 범위를 확대하여 RDX 스트레스 조건에서 세포반응과 프로테옴 프로필의 변화를 분석하였다. RDX 첨가 배지에서 xenA 돌연변이 균주는 야생균주와 비교하여 RDX를 약 2배 정도 느리게 분해하였으며, RDX 스트레스 하에서 xenA 돌연변이 균주의 생장률과 생존율은 야생균주와 비교하여 낮았다. RDX 스트레스에 의한 심한 형태적 손상이 xenA 돌연변이 균주의 세포 표면에 발생하는 것이 주사전자현미경을 통해서 확인되었다. RDX 스트레스 하에서 야생균주에서 발현된 충격단백질인 DnaK 및 GroEL의 양은 배양 초기 혹은 상대적으로 낮은 RDX 농도에서는 증가하였으나, 배양시간이 길어지거나 높은 RDX 농도에서는 다소 감소하였다. 그러나 xenA 돌연변이 균주에서는 DnaK와 GroEL의 발현양은 RDX 농도가 증가함에 따라 점차 감소되었다. RT-qPCR에 의해 측정된 야생균주에서 dnaA와 groEL의 전사 수준은 RDX 스트레스가 증가된 상태에서 잘 유지되었으나, xenA 돌연변이 균주에서는 점차 감소되어 결국에는 소멸되었다. RDX 스트레스에서 xenA의 돌연변이에 의한 프로테옴 프로필의 변화를 2-DE PAGE를 통해서 관찰한 결과에 따르면 27개 단백질이 감소하고 3개가 증가한 것으로 나타났다. 이들 결과로 보아, 정상적인 xenA 유전자는 RDX 스트레스 하에서 세포의 온전한 형태 유지와 효율적인 RDX 분해 과정을 수행하기 위해서 필요하다는 것을 의미하였다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
• /
• 제44권2호
• /
• pp.63-72
• /
• 2017

Objective: Hyperstimulation methods are broadly used for in vitro fertilization (IVF) in patients with infertility; however, the side effects associated with these therapies, such as ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS), have not been well studied. N-glycoproteomes are subproteomes used for the remote sensing of ovarian stimulation in follicular growth. Glycoproteomic variation in human follicular fluid (hFF) has not been evaluated. In this study, we aimed to identify and quantify the glycoproteomes and N-glycoproteins (N-GPs) in natural and stimulated hFF using label-free nano-liquid chromatography/electrospray ionization-quad time-of-flight mass spectrometry. Methods: For profiling of the total proteome and glycoproteome, pooled protein samples from natural and stimulated hFF samples were selectively isolated using hydrazide chemistry to obtain the total proteomes and glycoproteomes. N-GPs were validated by the consensus sequence N-X-S/T (92.2% specificity for the N-glycomotif at p<0.05). All data were compared between natural versus hyperstimulated hFF samples. Results: We detected 41 and 44 N-GPs in the natural and stimulated hFF samples, respectively. Importantly, we identified 11 N-GPs with greater than two-fold upregulation in stimulated hFF samples compared to natural hFF samples. We also validated the novel N-GPs thyroxine-binding globulin, vitamin D-binding protein, and complement proteins C3 and C9. Conclusion: We identified and classified N-GPs in hFF to improve our understanding of follicular physiology in patients requiring assisted reproduction. Our results provided important insights into the prevention of hyperstimulation side effects, such as OHSS.

• 원예과학기술지
• /
• 제33권2호
• /
• pp.242-250
• /
• 2015

기능 유전체 연구에서 이동유전자 또는 T-DNA 도입을 이용한 삽입돌연변이체 분석은 미지의 유전자 기능을 분석할 수 있게 한다. 이에 따라 본 연구에서는 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis)와 같은 고등 식물에서 genomic DNA조각을 분리할 수 있는 효과적인 PCR 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 variable argument thermal asymmetric interlaced PCR(VA-TAIL PCR)은 single-step annealin-gextension PCR 방법과 길게 구성된 유전자 특이적 primer 및 touch-up PCR 방법이 적용되었으며, 증폭 효율을 증가시키기 위하여 autosegment extension 증폭 방법이 적용되었다. 또한 개발된 VA-TAIL PCR 방법은 배추에 특화된 변성 primer를 Integr8 단백질체 데이터베이스를 분석하여 작성하였으며 대량의 배추 T-DNA 삽입 돌연변이 집단에서 각각의 T-DNA 인접 염기 서열을 분석하는 데 매우 정확하고 효과적인 것으로 분석되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 VA-TAIL PCR 방법은 기존에 확인된 염기 서열을 이용하여 양쪽 방향을 모두 분석할 수 있기 때문에, 유전체 연구에서 T-DNA 또는 기 밝혀진 염기 서열에 인접한 미지의 염기서열을 확인하는데 매우 효과적일 것으로 기대된다.

• KSBB Journal
• /
• 제26권6호
• /
• pp.517-522
• /
• 2011

In our previous study, we isolated and characterized a 1-deoxynojirimycin (DNJ)-producing bacterium, Bacillus subtilis MORI, from chungkookjang, a Korean traditional food. B. subtilis MORI was subjected to ${\gamma}$-irradiation and the resulting bacteria were screened for increased DNJ production. A mutant was identified that produced 7.6 times more DNJ and named B. subtilis MORI 3K-85. In this study, the protein profiles of both strains were compared by one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis (1-DE and 2-DE, respectively) under both native and denaturing conditions. The 1-DE native-PAGE and 1-DE SDS-PAGE analyses identified 5 and 7 bands, respectively, that were found at higher concentrations in B. subtilis MORI 3K-85 than in B. subtilis MORI. Similarly, 2-DE analyses identified 20 protein spots which were found at higher concentrations in B. subtilis MORI 3K-85. The peptide mass profiles of these 20 proteins were analyzed by MALDI-TOF and compared with peptide sequences of B. subtilis and B. amyloliquefaciens in the MASCOT database. This screening suggested that three dehydrogenases, an aldolase, a synthetase, an isomerase, a reductase, and a peroxidase are elevated in B. subtilis MORI 3K-85. Based on this data, one or more of the elevated 8 enzymes might be related to the DNJ biosynthetic pathway.