본 연구는 소포체스트레스(endoplasmic reticulum stress)에 의해 유발되는 지방간(hepatic steatosis)에 대한 오미자추출물(Schisandra chinensis)의 주요성분인 gomisin A의 지방간 보호 효능에 대하여 연구하였다. 이를 위해 HepG2 세포에 소포체스트레스 유도물질인 tunicamycin 또는 palmitate을 처리하여 세포에서의 지방간 모델을 만들어 실험을 진행 하였으며, 소포체스트레스 표지자(marker)인 GRP78, CHOP, XBP-1의 발현을 측정하였다. Tunicamycin 처리한 세포에서는 GRP78, CHOP, XBP-1의 발현이 증가되었으나, gomisin A를 처리 한 세포에서는 이들의 발현 증가가 억제됨을 확인하였다. 이는 palmitate를 처리한 HepG2 세포에서도 palmitate에 의해 증가하는 소포체스트레스 표지자들이 gomisin A을 처리한 세포에서 발현이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과에 의해, gomisin A는 소포체스트레스를 억제함을 알 수 있었다. 다음으로 gomisin A가 in vivo에서 소포체스트레스 및 지방간에 대한 보호효과가 있는지 확인하기 위해, tunicamycin과 고지방(high fat diet)으로 식이 한 쥐에서 소포체스트레스와 지방간의 보호효능에 대해 실험을 진행하였다. Tunicamycin과 고지방식이을 한 쥐의 간에서 중성지방이 증가하였으나, gomisin A를 처리한 쥐의 간에서 중성지방의 수준이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 소포체스트레스 표지자들 역시 tunicamycin이나 고지방식이을 한 쥐에서 증가되나 gomisin A를 처리한 쥐에서 감소됨을 확인하였다. Gomisin A의 염증 반응에서의 조절기능을 확인하기 위하여 $TNF-{\alpha}$, IL-6 그리고 MCP1과 같은 염증관련 유전자들의 발현을 분석한 결과, tunicamycin이나 고지방식이을 한 쥐에서 염증유전자들의 발현이 증가하였으나 gomisin A를 처리한 쥐에서는 유의적으로 감소하였다. 종합적으로 본 연구 결과에 의하면, gomsin A는 소포체스트레스를 억제하여 지방간의 생성을 저해함을 알 수 있었다.
석류(Punica granatum L.)는 생리활성이 강한 천연성분인 폴리페놀과 탄닌이 많이 함유되어 있어 예로부터 전통요법의 치료제로 사용되어 왔으며, 최근에는 석류의 phytoestrogen을 이용하여 갱년기 치료에 대한 연구가 활발히 진행중이다. 따라서 본 연구에서는 석류의 씨와 껍질의 ethanol 추출물과 석류 껍질 분획물을 이용하여 인위적으로 난소를 절제하여 폐경을 야기 시킨 흰쥐에서의 혈 중 지질 농도의 변화를 검토하였다. 그 결과 혈 중 total-cholesterol 및 triglyceride 농도에 있어서는 석류 ethanol추출물 투여에 의한 유의적인 효과는 없었으나, triglyceride의 경우 석류 껍질 추출물의 $200mg/kg{\cdot}bw/day$투여군에서는 OVX-control에 비하여 낮게 나타났다. 또한 혈 중 HDL-cholesterol농도는 석류씨와 껍질부분을 추출한 모든 실험군에서 동맥경화의 지표로서 관상성 심장질환에 대한 방어 작용을 가지고 있는 HDL-cholesterol 함량이 높게 나타났다. 특히 석류 껍질부분의 ethanol추출물의 경우 OVX-control에 비하여 유의적으로 나타나 갱년기장애로 인한 심혈관계 질환을 예방하는 천연 에스트로겐 대체 식품으로서의 귀추가 주목된다.
본 연구에서는 인위적 폐경을 유발시킬 수 있는 난소 절제 쥐에서와 돌나물 에탄을 추출물과 분획물의 혈 중 지질 함량 변화에 미치는 영향을 검토하였다. 난소 절제로 인해 야기되는 혈중 콜레스테를 함량의 증가는 돌나물 추출물 및 ethyl acetate 분획물의 투여에 의해 감소하는 경향이 나타났다. 혈중 중성지방 농도에서도 돌나물 분획물 투여가 유의적 감소 효과를 나타내었다. 한편, 혈 중 HDL-콜레스테를 함량은 난소 절제군에 비해 난소 절제 후 ethyl acetate 분획물을 투여한 군에서 그 수치가 유의적으로 증가 하였고, Sham군에 비해 오히려 더 증가하는 경향을 나타내었다. 혈중 중성지방 농도에서도 돌나물 분획물 투여가 유의적 감소 효과를 나타내었다. 돌나물 추출물과 분획물이 에스트로겐 감소로 인한 혈중 지질 대사에 효과를 나타낸 본 실험 결과를 미루어 보아, 돌나물 중의 에스트로겐 유사 효과를 나타내는 phytoestrogen이 있을 것으로 추론되고 이로 인해 외인성 에스트로겐 투여로 인한 부작용을 줄여 줄 수 있을 것으로 기대된다. 이상과 같은결과는 돌나물의 섭취가 폐경기 여성에게 폐경기 증상의 호전 및 순환계질환의 위험도를 감소시킬수 있을것으로 사료되어진다.
TRAIL은 최근 암세포의 apoptosis 유도를 위한 효율적인 도구로 제시되었으나 많은 암세포들이 TRAIL 저항성을 획득한 것으로 알려져 TRAIL 저항성 극복을 위한 새로운 방법론의 제시가 요구되어지고 있다. Genistein은 대두의 대표적인 생리활성 물질인 isoflavonoid의 일종으로 많은 암세포에서 G2/M arrest를 유발하면서 apoptosis를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 U937 인체백혈병세포를 대상으로 genistein에 의한 TRAIL 유도 apoptosis의 감수성 증대 여부를 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 U937 세포에서 세포독성이 없는 범위의 genistein 처리는 TRAIL에 의한 apoptosis 유도를 매우 증진시켰으며, 이는 tBid의 발현 증가와 cFLIPL의 발현 감소와 연계된 caspase의 활성 증가와 연관성이 있었다. 또한 caspase의 활성 저해제는 genistein과 TRAIL의 복합처리에 의한 apoptosis를 유의적으로 감소시켜 복합 처리에 의한 apoptosis의 유도에 caspase의 활성 증대가 필수적임을 알 수 있었다. 따라서 genistein은 TRAIL 저항성을 획득한 암세포의 효율적인 combined therapy approach를 위해 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
45종 식용 및 약용식물 에탄을 추출물의 에스트로젠 활성 및 항산화활성을 측정하였고 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 측정 비교하였다. 재조합 효모법을 이용하여 에스트로젠 활성을 측정한 결과 감초, 강황, 경포부자, 구아바, 느릅(줄기), 도꾸다미, 백화사설초, 대황, 상백피(중국산), 상황버섯, 석류, 복분자(과육, 씨), 원지, 은행, 초두구, 홍화, 황정이 유의적으로 높은 활성을 나타내었다. 특히, 감초와, 대황은 $100{\mu}g/mL$의 농도에서 1mg/mL 보다 더 높은 활성을 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능과 TBARS 생성 억제능 두 가지가 모두 우수한 소재는 감초, 구아바, 느릅, 대황, 복분자, 초두구였다. 총 폴리페놀은 초두구가 594.7mg/g catechin eq.으로 가장 높았으며 삼칠근이 8.6mg/g catechin eq.으로 가장 낮았고, 플라보노이드 함량은 강황이 약 394.9mg/g naringin eq.으로 가장 높았고 황정이 1.7mg/g naringin eq.으로 가장 적었다. 폴리페놀의 함량이 높은 식물의 대부분이 플라보노이드의 함량도 많았다. 시료 추출물의 라디칼 소거 활성과 폴리페놀 함량간에 양의 상관관계를 나타내었으나$(r^2=0.61)$, 지질 과산화 억제능 및 에스트로젠 활성과 폴리페놀 함량 간에는 유의적인 상관성이 적었다. 감초, 대황은 에스트로젠 활성이 높으면서 항산화능이 높았다. 이상의 결과는 파이토에스트로젠 활성을 가진 천연 소재를 선정하는데 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
콩에 함유되어 있는 이소플라본은 골다공증 예방 및 치료제로써의 활발한 연구가 진행중이다. 콩은 우리의 식생활과 깊은 관련성이 있으므로 이소플라본의 함량을 HPLC로 정량분석 하였다. 한국산 황기와 콩제품인 콩나물, 두부, 콩기름, 메주, 된장, 간장, 대두, 약콩, 완두콩 및 강남콩 등에서 함유된 isoflavone을 5mM $NaH_2PO_4$ 완충용액(pH 4.6)과 메탄올을 혼합한 이동상 (4 : 6) UV 260 nm에서 분석하였다(Table 2). 콩식품에 함유된 isoflavone중 유리 daidzein 양은 콩나물에서 $43.49{\pm}3.41\;mg/kg$, 된장에서 $233.31{\pm}5.81\;mg/kg$, 약콩은 $35.66{\pm}4.70\;mg/kg$이 검출되어 대두 $(14.52{\pm}0.58\;mg/kg)$ 비해 높았다. (P<0.05)간장 및 콩 기름은 함량이 낮았고, 완두콩 및 강남콩의 함량은 측정치 이하였다. 유리 genistein은 콩나물이 $27.631{\pm}1.66\;mg/kg$,메주가 $18.75{\pm}1.33mg/kg$, 된장이 $291.52{\pm}6.81\;mg/kg$ 검출되었고, 대두는 $22.49{\pm}0.93mg/kg$으로 약콩$(61.10{\pm}7.73mg/kg)$ 보다 낮았다(P<0.01). 그러나 formononetin의 함량은 daidzein, genistein과는 다른 양상을 보였으며, 특히 황기는 daidzein과 genistein은 검출되지 않았으나 formononetin의 함량이 대두$(60.62{\pm}11.35\;{\mu}g/kg)$ 비해 $9629.73{\pm}0.57\;{\mu}g/kg$으로 약 160배 이상 많았고, 약콩은 대두와 유사하였으나, 콩기름, 완두콩, 강남콩에서는 formononetin이 검출되지 않았으며, 전통식품인 된장과 메주에도 상당량 함유되어 있었다.
감국 에탄올 추출물이 $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 MC3T3-E1 조골세포의 증식 및 분화, ROS 생성 및 염증 매개성 cytokine인 TNF-${\alpha}$ 생성 등에 미치는 영향을 분석하였다. $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 감국 에탄올 추출물은 30-100 ${\mu}g/mL$ 농도 범위에서 조골세포의 증식을 유의적으로 증가시켰다. 또한, 감국 에탄올 추출물 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 ALP 활성이 약 1.5배 유의적인 증가를 나타냈다. 그러나 collagen 합성에는 유의적 차이를 보이지 않았다. Mineralization 측정에서는 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 대조군에 비해 유의적 증가를 보였다. $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 감국 에탄올 추출물이 intracellular ROS 생성에 미치는 영향을 측정해본 결과, 30 ${\mu}g/mL$ 농도에서 antioxidant인 trolox 20 ${\mu}M$과 유사한 ROS 생성수준을 나타내어 유사한 항산화 효과를 보였으며, 그 이상의 농도에서는 더 높은 항산화 효과를 나타냈다. $H_2O_2$로 유도한 산화적 스트레스 상황에서 조골세포의 collagen 및 ALP의 합성을 억제하고 파골세포로의 분화 증강과 골흡수를 촉진시키는 것으로 알려진 TNF-${\alpha}$ 생성정도를 측정한 결과, 감국 에탄올 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 생성이 감소되었으며, 200 ${\mu}g/mL$ 농도에서 대조군 대비 89% 수준을 나타내어 유의적 차이를 보였다. 이상의 결과를 통해 감국 에탄올 추출물은 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스 상황에서 세포 내 ROS 생성과 염증매개 cytokine인 TNF-${\alpha}$ 생성을 감소시킴으로써 조골세포 손상과 활성 감소를 억제하고, 증식과 분화를 촉진시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 감국 에탄올 추출물의 골다공증 예방을 위한 식물성 에스트로젠(phytoestrogen) 및 항산화 소재로의 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 T24 인체방광암 및 U937 백혈병 세포의 증식에 미치는 genistein의 영향을 조사 하였다. Genistein이 처리된 T24 및 U937 세포는 처리 농도 의존적으로 세포의 증식이 현저히 감소되었으며 심한 형태적 변형이 동반되었으나, U937 세포에서 보다 높은 감수성을 보였다. 이러한 T24 및 U937 세포의 증식억제 및 형태 변형은 G2/M기의 세포주기 억제 및 apoptosis 유발과 연관성이 있음을 flow cytometry를 이용한 세포주기의 분석을 통하여 확인하였다. T24 세포에서 genistein에 의한 G2/M arrest는 cyclin A, cyclin B1 및 Cdc25C 등의 단백질 발현 감소와 연관성이 있었으나, 종양억제 유전자 p53 및 Cdk inhibitor p21의 발현에는 큰 변화가 없었다. U937 세포에서 genistein에 의한 G2/M arrest는 cyclin B1 및 p53 비의존적인 p21의 발현 증가와 연관성이 있었다. 이상의 결과들은 현재까지 거의 연구가 진행된 바 없는 인체방광암 및 백혈병 세포에서 genistein의 항암작용을 이해하는데 중요한 자료가 될 것이고 나아가 genistein을 포함한 그와 유사한 항암제 후보물질들의 연구에 있어서 기초 자료로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
여성의 폐경에 의한 estrogen의 감소는 골다공증을 유발시킨다고 알려져 있다. 최근 새로운 식품으로 각광받고 있는 매생이 추출물을 인위적 갱년기 장애를 유발시킨 흰쥐에 투여하여 혈 중 ALP활성 변화와 골 중의 collagen의 함량 및 collagen 가교물질 pyridinoline과 deoxypyridinoline 함량 변화를 측정하여 그 효과를 검토해 보았다. 매생이 추출물을 갱년기를 유도한 흰쥐에 투여하여 혈 중 ALP활성 변화에 미치는 영향을 검토한 결과 난소절제에 의하여 ALP활성이 증가하였으나, 매생이 추출물 투여한 군에서 ALP활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 난소절제에 의해 연골의 collagen 함량이 감소되었는데, 이는 매생이 추출물을 투여함으로써 정상적인 수치로 증가하는 경향을 나타내어 매생이 추출물이 골 대사와 관련된 골 대사질환에 유효한 효과를 나타낼 것으로 추측된다. 또한 collagen 가교물질로써 골대사의 biomaker인 pyridinoline 및 deoxypyridinoline의 연골 중의 함량은 난소절제에 의해 감소하였고, 매생이 추출물 투여에 의해 증가하여 estrogen부족으로 인한 골 손실에 매생이 추출물이 유익한 효과를 가지는 것으로 보이며, 이는 매생이 중에 함유되어 있는 phytoestrogen에 의한 것으로 추측되어 앞으로 구체적인 검토가 필요한 것으로 사료된다.
The proliferative effects of thirty Oriental medicinal herbs on MCF-7 (estrogen-sensitive breast cancer cell line) and ROS 17/2.8 osteoblast-like cells were determined using the MTT assay. Methanol extracts from several herbs was found to show proliferative activity on the above two cell lines in the range of 5 to 100 $\mu$g/mL. Among these active herbs, the methanol extract from the rhizomes of Drynaria fortunei showed the most potent proliferative activity, and the cell proliferations were significantly increase by 136 and 158% in the MCF-7 and ROS 17/2.8 cells, respectively, when treated with 100 $\mu$ g/mL. Through a bioassay-guided separation, eight flavonoids, including four new flavan-3-ols and two propelargonidins, together with the known (-)-epiafzelechin and naringin, were isolated. Their chemical structures were characterized as (-)-epiafzelechin (1), (-)-epiafzelechin-3-O-$\beta$-D-allopyranoside (2), (-)-epiafzelechin-3-O-(6"-O-acetyl)-$\beta$-D-allopyranoside (3), 4$\beta$-carboxymethyl-(-)-epiafzelechin methyl ester (4), 4$\beta$-car-boxymethyl-(-)-epiafzelechin sodium salt (5), naringin (6), (-)-epiafzelechin-(4$\beta$\rightarrow8)-4$\beta$-car-boxymethylepiafzelechin methyl ester (7) and (-)-epiafzelechin-($4\beta\rightarrow8, 2\beta\rightarrowΟ\rightarrow7)-epiafzelechin-(4\beta\righarrow8)-epiafzelechin (8) by extensive 1D and 2D NMR spectroscopy. Most of these flavonoids, in the range of $10^{-15}∼10^{-6}$ M, accelerated the proliferation of MCF-7 cell, with compounds 7 and 8, in the range of $10^{-15}∼10^{-12}$ M, showing especially potent proliferation effects. Meanwhile, seven flavonoids, with the exception of compound 4, stimulated the proliferation of ROS 17/2.8 cells in the range of $10^{-15}∼10^{-6}$ M, with compounds 5-8 especially accelerating the proliferation, in dose-dependent manners ($10^{-15}∼10^{-9}$ M), and their proliferative effect was much stronger than that of $E_2$ and genistein. These results suggest that propelargonidin dimers and trimers isolated from the rhizomes of Drynaria fortunei may be useful as potential phytoestrogens, which play important physiological roles in the prevention of postmenopausal osteoporosis.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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