• 미생물학회지
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• 제54권2호
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• pp.126-135
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• 2018

여러 종류의 mannanase를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43으로부터 mannanase B를 암호하는 manB 유전자와 효소의 특성이 보고된 바 있다. Mannanase C (ManC)로 명명한 효소의 유전자가 manB 유전자의 하류에 위치한 것으로 예상되어 이를 중합효소 연쇄반응으로 클로닝하여 manC 유전자의 염기서열을 결정하였다. ManC는 448 아미노산 잔기로 구성된 것으로 확인되었으며 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역(CBM2)이 존재하였다. ManC의 활성영역은 Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) 및 S. thermoluteus (57.6%; BAM62868)의 mannanase와 아미노산 배열의 상동성이 55% 이상으로 가장 높았다. Signal peptide 영역이 제거되고 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged ManC (HtManC)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtManC를 정제하였다. HtManC은 $65^{\circ}C$와 pH 7.5에서 최대 활성을 보였으며 pH 7.5~10범위에서 활성에 큰 변화가 없었다. HtManC는 locust bean gum (LBG)과 konjac에 대한 분해 활성이 guar gum과 ivory nut mannan (ivory nut)에 비해 높았다. 최적 반응조건에서 LBG를 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 Vmax와 Km이 68 U/mg과 0.45 mg/ml로 나타났다. HtManC에 의한 만노올리고당(MOS)과 mannan의 분해산물을 TLC로 관찰한 결과 mannobiose 보다 중합도가 큰MOS로부터 mannobiose와 mannotriose가 주된 분해산물로 생성되었다. 또한 LBG, konjac과 ivory nut의 분해산물로 mannobiose와 소량이 mannose가 공통적으로 관찰되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권4호
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• pp.347-351
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• 2004

Hydrolysis of manno-oligosaccharides and galactomannan was studied with the purified Bacillus subtilis WL-7 mannanase from recombinant Eschericoli. The predominant products of hydrolysis were mannose, mannobiose and mannotriose. The enzyme could hydrolyze $\beta$-1 A-linked manno-oligosaccharides larger than mannobiose, but was not active on mannobiose. When the mannanase hydrolyzed manno-oligo saccharides of degree of polymerization(DP) 4-6, it was more active on the substrate of higher DP. Based on analysis of transient reaction products by TLC, the enzyme was found to have a preference for internal $\beta$-IA-mannosidic linkages, which are the central mannosidic bond of mannotetraose and the two middle mannosidic bonds of mannopentaose. The $\beta$-l A-mannosidic bonds situated at the second and fourth positions from the nonreducing end of mannohexaose were preferenhydrolyzed by the mannanase. Locust bean gum(LBG) was enzymatically hydrolyzed with higher efficiency than guar gum, resulting that amount of reducing sugars was liberated more efficiently from LBG than guar gum with same activity of mannanase.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권4호
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• pp.431-439
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• 2014

We report the construction of two Bacillus subtilis expression vectors, pBNS1/pBNS2. Both vectors are based on the strong promoter P43 and the ampicillin resistance gene expression cassette. Additionally, a fragment with the Shine-Dalgarno sequence and a multiple cloning site (BamHI, SalI, SacI, XhoI, PstI, SphI) were inserted. The coding region for the amyQ (encoding an amylase) signal peptide was fused to the promoter P43 of pBNS1 to construct the secreted expression vector pBNS2. The applicability of vectors was tested by first generating the expression vectors pBNS1-GFP/pBNS2-GFP and then detecting for green fluorescent protein gene expression. Next, the mannanase gene from B. pumilus Nsic-2 was fused to vector pBNS2 and we measured the mannanase activity in the supernatant. The mannanase total enzyme activity was 8.65 U/ml, which was 6 times higher than that of the parent strain. Our work provides a feasible way to achieve an effective transformation system for gene expression in B. subtilis and is the first report to achieve B. pumilus mannanase secretory expression in B. subtilis.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권6호
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• pp.1295-1302
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• 2004

A gene encoding the mannanase of Bacillus subtilis WL-7, which had been isolated from Korean soybean paste, was cloned into Escherichia coli, and the gene product was purified from the culture filtrate of the recombinant E. coli. This mannanase gene, designated manA, consisted of 1,086 nucleotides, encoding a polypeptide of 362 amino acid residues. The deduced amino acid sequence was highly homologous to those of mannanases belonging to the glycosyl hydrolase family 26. The molecular mass of the purified mannanase was 38 kDa as estimated by SDS-PAGE. The enzyme had a pH optimum at 6.0 and a temperature optimum at $55^{\circ}C$. The enzyme was active on locust bean gum, konjak, guar gum, and lichenan, while it did not exhibit activity towards yeast mannan, laminarin, carboxymethylcellulose, $\beta$­glucan, xylan, and para-nitrophenyl-$\beta$-mannopyranoside.

• Applied Biological Chemistry
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• 제48권4호
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• pp.364-369
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• 2005

Trichoderma harzianum이 생산하는 ${\beta}-mannanase$의 최적 사면배지조성은 2.0% malt extract, 2.0% glucose, 0.1% peptone, 2.0% agar로, 효소생산 배지조성은 3.0% cellulose, 3.0% C.S.L, 1% $KH_2PO_4$, 0.2% $(NH_4){_2}SO_4$로 결정되어 $28^{\circ}C$, 130 rpm, 진탕배양법으로 조효소액을 생산하였다. ${\beta}-mannanase$의 최적 pH와 최적온도는 pH 4.5, $60^{\circ}C$에서 최대 상대활성을 나타내었다. Locust bean gum에 대한 효소적 가수분해 pattern을 TLC에 의해 검토한 결과 반응초기부터 반응말기까지 주요 생성물은 단당류, 중합도 4와 7의 올리고당으로 확인되었다. 중합도별 올리고당을 조제하기 위하여 activated carbon column chromatography에 250 ml/hr유속으로 tube당 20 ml씩 ethanol $0{\sim}50%$의 gradient법으로 분리 회수하였고, 분리된 각각의 올리고당 중 중합도4는 TLC $R_f$ value상으로 ${\beta}-1,4-mannotetraose$로, 중합도 7은 Methylation method에 의해 M-M-M-M-M 구조로 //G-G 동정되었다. (G-와 M-은 각각 ${\alpha}-1,6-D-galactosidic,\;{\beta}-1,4-mannosidic$ 결합을 나타냄). Bifidobacterium longum에 대한 생육활성을 기존의 MRS media와 탄소원으로 중합도 4와 7의 올리고당으로 대체하였을때 3.4배, 4.3배의 생육활성이 증가하였고, Bifidobacterium bifidum에 대해서는 1.2배, 1.1배의 낮은 활성을 나타내었다.

• 생명과학회지
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• 제19권12호
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• pp.1724-1730
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• 2009

진주산업대학교 농장에서 사육되고 있는 말에서 채취한 분변으로부터 mannanase 생성능이 우수한 균주를 분리하였으며 이를 CS47이라 명명하였다. 통성혐기성인 분리균 CS47의 최적 생육온도는 $38^{\circ}C$였으며 $20^{\circ}C$에서부터 $50^{\circ}C$까지 다양한 온도범위에서도 생육이 가능한 것으로 확인되었다. BIOLOG를 이용하여 분리균 CS47의 생화학적 특징을 분석한 결과, 분리균은 Bacillus amyloliquefaciens 균주와 유사한 특성을 나타내었으며 DNA G+C함량 (44mol%)도 B. amyloliquefaciens 균주의 범위(43.5-44.9)에 속하였다. 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과에서도 분리균은 B. amyloliquefaciens FZB42 균주와 가장 높은 상동성을 나타내었으며 Bacillus속의 다른 균주들과는 93-98%의 상동성을 나타내었다. 그러나 분리균의 세포벽을 이루고 있는 주요 지방산[anteiso-15:0 (39.6%), 17:0 (7.6%), iso-15:0(37.8%)]은 Bacillus subtilis 균주와 유사한 특성을 나타내었다. 최종적으로 생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열분석 결과를 근거로 하여 분리균 CS47은 Bacillus amyloliquefaciens CS47로 동정되었다. B. amyloliquefaciens CS47 균주가 분비하는 mannanase는 $50^{\circ}C$, pH 6.0에서 가장 높은 활성을 보였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권3호
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• pp.277-283
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• 2003

전통 발효식품인 된장으로부터 mannanas의 생산균으로 분리된 WL-7균주는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA의 염기서열에 근거하여 Bacillus subtilis로 동정되었다. B. subtilis WL-7의 배양상등액으로 제조한 조효소액을 이용하여 mannanase 활성을 측정한 결과, 55$^{\circ}C$와 pH 6.0에서 최대활성을 보였으며 , 반응온도 $50∼60^{\circ}C$와 반응 pH 5.0∼7.5에서 최대활성의 90% 이상의 활성을 나타냈다. 분리균WL-7의 mannanase생산성을 높이기 위해 LB배지에 소당류와 고분자 탄수화물을 첨가하여 배양한 결과, lactose, 밀기울, avicel, $\alpha$-cellulose, locust bean gum(LBG), konjak 등에 의해 mannanase생산성이 상당량 증가되었다. 특히 0.5% LBG와 0.5% konjak이 동시에 첨가된 LB 배지에서 10시간 배양하였을 때 배양상등액의 효소 활성이 224 U/ml로 최대 효소생산성을 보였으며, 이는 LBC와 konjak을 첨가하지 않은 배지에서 보다 효소 생산성이 200배 이상이 증가하였다. LBG와 konjak을 첨가하였을 때 B. subtilis WL-7의최대성장도가 약간 증가한 것에 비해 mannanase생산성은 현저히 증가된 것으로 보아 배양액 중의 LBG와 konjak의 가수분해 산물이 mannanas리 생합성을 유도한 것으로 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제26권10호
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• pp.1113-1120
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• 2016

우리나라의 전통 발효 된장으로부터 균체외 효소로 mannanase를 생산하는 세균 2주가 분리되었다. 분리균 WL-6과 WL-11은 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rDNA의 염기서열에 따라 Bacillus subtilis로 확인되었다. 이들 두 균주로부터 각각 mannanase 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 동일하게 이루어졌다. WL-6과 WL-11 mannanase (Man6, Man11)의 아미노산 잔기 배열은 서로 8개 잔기가 다르며 GH family 26에 속하는 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. Man6과 Man11의 아미노 말단의 26개 아미노 잔기가 signal peptide로 예측되었다. 재조합 대장균로부터 각각 생산된 Man6과 Man11은 94~95% 정도가 균체내에 존재하였고, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당과 locust bean gum을 유사하게 분해하여 주된 반응산물로 mannobiose와 mannotriose를 생성하였다. Man6는 55℃와 pH 6.0, Man11은 60℃와 pH 5.5에서 각각 최대 반응활성을 보였으며, Man11이 Man6에 비해 열안정성이 높았다.

• 미생물학회지
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• 제46권4호
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• pp.397-400
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• 2010

만난의 분해활성을 갖는 Paenibacillus woosongensis의 배양 상등액으로부터 mannanase, ${\beta}$-mannosidase와 ${\alpha}$-galactosidase 활성이 관찰되었다. 배양상등액 내의 locust bean gum를 분해하는 mannanase는 pH 5.5와 $60^{\circ}C$, para-nitrophenyl-${\beta}$-D-mannopyranoside를 분해하는 ${\beta}$-mannosidase는 pH 6.5, $50^{\circ}C$, para-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactopyranoside를 분해하는 ${\alpha}$-galactosidase는 pH 6.0-6.5와 $50^{\circ}C$에서 각각 최대활성을 보였다. 배양상등액의 만난 분해효소는 mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당을 분해할 뿐 아니라 mannobiose도 분해하였다. 또한 melibiose, raffinose, stachyose 등의 ${\alpha}$-1,6 결합형 galacto-oligosaccharides를 분해하여 galactose를 생성하였다. 이러한 결과로 보아 P.woosongensis는 galactomannan을 완전히 분해하는데 필요한 3종류 효소를 모두 생산하는 것으로 판단된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제51권3호
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• pp.159-163
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• 2008

Sephadex G-100 column chromatography에 의해 Xylogone sphaerospora 유래 ${\beta}$-mannanase의 정제를 수행하여 비활성 8.44 units/ml, 정제배율 56.27을 나타내었다. SDS-PAGE에 의한 단일밴드를 확인하였고, 분자량은 42kDa으로 결정되었다. 정제효소에 의해 konjac glucomannan을 가수분해하여 activated carbon column chromatograph)에 의해 당가수분해물을 분리 회수하여 TLC에 의해 주요 당가수분해물은 합도 3과 4의 hetero type으로 확인되었으며 D.P. 3과 4의 예상되는 구조는 본 연구실에서 확보하고 있는 standard glucomannooligosaccharides에 의한 TLC에서 나타나는 Rf value 상으로 1차적으로 확인하고, Aspergillus niger 5-16 유래 정제 ${\beta}$-mannanase를 단계적으로 처리하여 가수분해 pattern을 TLC로 해석한 결과 D.P. 3의 구조식은 비환원말단 mannose로 부터 2번째에 1분자의 glucose가 결합하고 있는 hetero type의 구조(M-G-M)로, D.P. 4의 구조식은 비환원말단 mannose로부터 3번째에 1분자의 glucose가 결합하고 있는 hetero type의 구조(M-M-G-M)로 예상하고 있다. B. longumm, B. bifidum, B. infantis, B. adolescentis, B. animalis, B. auglutum, B. breve의 생육활성에 대한 중합도 3과4의 영향을 검토하기 위하여 modified-MRS 배지 상에 탄소원으로 중합도 3과 4를 대체하여 생육활성을 비교한 결과 B. longum에서는 D.P 4 glucomannooligosaccharide를 탄소원으로 대체한 경우 표준 MRS배지와 비교하여 3.9배의, D.P. 3을 처리한 경우에도 2.7배의 상대 활성을 나타내어 가장 우수한 생육활성을 나타냈었으며, B. breve의 경우에서도 D.P 4에서 2.47배, D.P 3에서 2.08배의 활성을 나타내었으며 B. bifidum에 있어서는 D.P. 4의 경우 2.8배의 상대활성을 나타내었다. Bifidobacterium 7균주 모두에 대해서 중합도 4의 올리고당이 중합도 3의 올리고당보다 생육활성에 크게 기여하는 것으로 나타났다.