• 생명과학회지
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• 제29권8호
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• pp.895-903
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• 2019

이 연구는 단일 세포로 분리된 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)에 anoikis 세포사멸을 억제할 수 있는 Rho-associated protein kinase (ROCK)의 억제제를 처리하여 iPSCs의 세포 생존성을 향상하고자 하였다. Episomal plasmid 방법으로 확립된 iPSCs를 단일세포로 분리한 후, ROCK 억제제 Y-27632 dihydrochloride (Y-27632)를 0 uM, 0.5 uM, 1 uM, 2.5 uM, 5 uM, 7.5 uM 및 10 uM 농도별로 5주일 동안 각각 처리하였을 때, 5 uM 이상의 농도에서 세포의 생존율이 유의적으로 향상되었고, 10 uM의 Y-27632을 0일, 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일 동안 처리하였을 때, Y-27632의 노출 기간이 길어질수록 세포의 생존율이 유의적으로 향상되는 것을 관찰하였다. 그러나, Y-27632의 노출 후, iPSCs의 형태학적 분화가 관찰되어 10 uM의 Y-27632에서 5일 동안 iPSCs에 처리 한 후, 줄기세포학적인 특성을 비교 조사하였다. 우선, octamer-binding transcription factor 4 (OCT-4), homeobox protein NANOG (NONOG) 및 SRY-box 2 (SOX-2) 줄기세포 특이 유전자의 발현은 Y-27632를 처리한 실험군은 Y-27632를 처리하지 않은 대조군에서 서로 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, Y-27632를 처리한 실험군은 Y-27632를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 telomerase 활성과 이것의 활성과 관련된 telomerase reverse transcriptase (TERT) 및 telomerase RNA component (TERC)의 유전자 발현에는 유의적인 차이가 없었다. 이상의 결과로 보아, iPSCs에 Y-27632를 처리하였을 때, iPSCs의 줄기세포의 특정을 유지하면서 anoikis에 의한 세포사멸을 감소시켜 세포 생존율이 증가한다는 것을 알 수 있었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권3호
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• pp.245-251
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• 2007

Dicarboximide계 살균제인 vinclozolin(VCZ)은 과일, 야채, 관상용 식물에서 미생물에 의해 유발되는 병들을 통제하는데 사용되어왔다. VCZ의 대사산물인 M1과 M2는 흔히 토양, 식물, 포유류에 잔존하기 때문에 인간에게 노출될 가능성이 크다. VCZ가 갖는 항안드로겐성 활성 때문에 주로 수컷에 대한 연구가 이루어졌으며, 암컷의 사춘기와 생식계에 미치는 영향은 연구가 미비한 실정이다. 따라서 본 연구는 VCZ가 암컷 흰쥐의 사춘기 개시와 이와 관련된 생식 지표들의 변화에 미치는 효과를 조사하였다. 생후 21일부터 vehicle(DMSO) 또는 VCZ(10 mg/kg/day i.p.)를 사춘기 개시의 지표인 질구 개방(vaginal opening, V.O.)이 일어나는 날까지 투여하였다. 질구 개방이 일어난 날 오후에 희생시킨 후 난소와 자궁의 외양과 조직 무게를 측정하여 VCZ가 이들 조직에서의 세포 증식에 미치는 효과를 조사하였고, 현미경 관찰을 통해 해부학적인 변화 양상을 조사하였다. 또한, 면역조직화학법을 수행하여 단백질 수준에서의 유전자 발현을 조사하였다. 자궁 성숙의 지표인 프로게스테론 수용체(PR) 발현 양상은 정량적인 RT-PCR로 확인하였다. 결과로, VCZ 투여에 의해 질구 개방이 지연됨을 확인하였다(PND $34.00{\pm}1.22$ in control group vs PND $38.20{\pm}1.92$ in VCZ group, p<0.05). 그러나 체중 변화의 경우, 대조군과 VCZ군 간 유의한 차이가 나타나지 않았다. 난소와 자궁의 크기와 무게는 대조군에 비해 VCZ군에서 유의하게 감소하였다. 질구 개방이 일어난 대조군의 난소에서는 성숙의 지표인 그라프 난포(Graafian follicle)와 황체가 관찰되었으나, VCZ군의 난소에서는 미성숙한 1차, 2차 난포 그리고 작은 퇴화 난포(atretic follicle)들만이 다수 관찰되었다. 자궁의 경우도 대조군에서는 내막층과 근막층은 물론 상피층까지 잘 발달된 과다 성장 상태와 함께 분비선 수의 증가가 관찰되었으나, VCZ군에서는 모든 세포층과 분비선의 발달이 미약한 상태였다. RT-PCR 결과, 난소(p<0.01)에서의 PR mRNA 수준은 VCZ 투여에 의해 유의한 발현 감소가 나타났다. 결론적으로, 본 연구는 사춘기 개시 전 특정시기에 단기적인 VCZ 투여에 의해 암컷 흰쥐의 생식계 활성화가 억제되고, 그 결과 사춘기 개시가 지연될 수 있음을 시사한다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제33권2호
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• pp.131-139
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• 2018

본 연구는 자색옥수수 색소 1호 포엽과 속대 추출물의 항비만 활성을 검정하고자 지방분해효소 저해활성을 평가하고 3T3-L1 지방전구세포에서 지방분화억제 효과를 검정하고자 수행되었다. Pancreatic lipase 저해 활성 결과, 색소 1호 포엽 및 속대 추출물의 100, 500, $1,000{\mu}g/mL$ 농도처리구에서 양성대조군인 orlistat 보다 높은 저해 활성을 나타내었다. 3T3-L1 지방전구세포를 배양하여 색소 1호 포엽 및 속대 추출물의 세포독성 평가를 수행한 결과, 추출물은 모든 처리농도에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다. 분화된 3T3-L1 지방전구세포에서 색소 1호 포엽과 속대 추출물을 처리하지 않고 분화시킨 대조군은 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되었으나 색소 1호 포엽 및 속대 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 lipid droplet의 형성이 억제되는 것으로 나타났다. Real-time PCR과 Western blot을 실시하여 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$ 유전자 및 단백질 발현량을 측정한 결과, 추출물을 처리하지 않고 분화시킨 대조군에서는 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$의 유전자 및 단백질 발현이 증가하였으며, 추출물 처리에 의해 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$의 유전자 및 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다. 본 연구 결과는 색소 1호 포엽 및 속대 추출물이 pancreatic lipase 활성 및 지방전구 세포의 분화를 억제시킴으로써 항비만 활성 기능성 물질로의 활용 가능성이 높음을 시사한다.

• 대한한방내과학회지
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• 제29권2호
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• pp.334-347
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• 2008

Background and Objective : Haeyeol-tang, composed of Houttuyniae Herba, Lonicerae Flos, Taraxaci Herba, and Scrophulariae Radix, is widely used for alleviating the symptom of various kinds of inflammatory pulmonary disease, including asthma and COPD. We want to know whether Haeyeol-tang has an anti-inflammatory effect by analyzing expression of pro-inflammatory cytokines. Materials and Methods : We differentiated the THP-1 cells into macrophage-like cells by treatment with PMA. Inflammation was induced by treatment with LPS and PMA. We found the safe concentration of Haeyeol-tang by using MTS assay and used PD98059 as a negative control for comparison of anti-inflammatory effect of Haeyeol-tang. Results : The RT-PCR analysis results show that the cell survival rate is over 100% within 1 ng/mL to 1 ug/mL of Haeyeol-tang and begins to decrease under 100% at 10 ug/mL. The gene expression of $IL-1{\beta}$, IL-6, IL-8, IL-10, $TNF-{\alpha}$ and $TGF-{\beta}$ levels were down-regulated when Haeyeol-tang was treated at concentrations between 1 ng/mL an 1 ug/mL on monocyte-derived macrophages. Interestingly, 1 ug/mL Haeyeol-tang-treated samples showed that the transcriptional activities of IL-8, $TNF-{\alpha}$, IL-10 and $TGF-{\beta}$ were more down-regulated than those of PD098059 $(TNF-{\alpha}$ inhibitor). At protein level, the ELISA analysis results showed that there were more remarkable (p<0.001) decreases in expression of $IL-1{\beta}$, IL-6, IL-8 and $TNF-{\alpha}$ on both the 1 ug/mL Haeyeol-tang-treated group and the PD98059-treated group than the LPS-treated group. Conclusion : We conclude that Haeyeol-tang has an anti-inflammatory effect by inhibiting expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines at mRNA and protein levels. These results may provide us a promising way to care for general inflammatory diseases as well as inflammatory pulmonary disease, including asthma and COPD, with further clinical study.

• 생명과학회지
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• 제14권6호
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• pp.967-974
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• 2004

골조직은 골아세포, 파골세포, 골세포 등으로 구성되며, 골개조시 여러 인자가 세포증식, 분화, 활성화 및 골대사 조절에 관여한다. 이때 조골세포의 활성은 골형성에 중요하므로, 본 연구에서는 MC3T3-E1 조골세포주를 이용하여 식용자원인 복분자의 조골세포의 증식과 분화활성에 미치는 영향을 조사하였다. 복분자 추출물이 조골세포의 성장에 미치는 영향을 MTT 검색법으로 조사한 결과, 복분자 추출물 $10\;{\mu}g/mL$ 처리시 대조군과 비교하여 $142\%$ 증가하여 조골세포에 대해 높은 성장률을 보였다. 복분자 추출물이 ALP 효소 활성에 미치는 영향을 3일 간격으로 배지교환 및 시료처리를 하면서 27일 동안 배양시간에 따른 변화를 측정하여 조사하였다. 그 결과, 농도 1, 10, $100\;{\mu}g/mL$ 처리시 $100\;{\mu}g/mL$을 제외한 나머지 분획물들이 시간이 지남에 따라 ALP 활성을 증가시켰고, $10\;{\mu}g/mL$ 농도의 추출물은 27일째에 대조군에 비해 약 2.6배 이상, 양성대조군에 비해 약 1.5배 이상 ALP 활성을 증가시켰다. 복분자 추출물은 다시 ALP 효소 염색법과 Alizarin Red 염색으로 조골세포의 ALP활성유도, 분화와 석회화 형성능을 재확인하였으며 골기질 유전자의 발현의 변화도 확인하였다. 따라서 종래의 골질환에 좋다고 알려진 식품인 복분자 추출물이 양성대조군에 비해 빠르게 세포 증식과 분화를 유도하고 있어 앞으로 복분자에 대한 좀 더 깊은 분자생물학 수준 등의 구체적인 연구들과 기작연구가 지속적으로 이루어져야 할 것이라 추측된다.

• 대한화장품학회지
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• 제36권3호
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• pp.183-191
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• 2010

본 연구에서는 가막살나무(Viburnum dilatatum Thunb.)의 잎과 세지로부터 유래되는 천연화학성분들을 얻고, 이들의 자극완화용 화장품 소재로써의 가능성을 확인하기 위하여 항산화 효능 및 항염증 효능을 조사하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용한 전자공여능 측정방법에 의한 항산화 효능 조사 결과, 가막살나무의 에탄올(Ethanol) 추출물($SC_{50}\;=\;17.03\;{\mu}g/mL$), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획물($SC_{50}\;=\;13.97\;{\mu}g/mL$), 부탄올(butanol) 분획물($SC_{50}\;=\;10.30\;{\mu}g/mL$) 순으로 항산화능력이 증가함을 알 수 있었다. 그러나 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 활성화된 마우스 대식세포(RAW264.7 cells)에서 생성되는 산화질소(nitric oxide : NO) 생성의 억제능을 조사한 결과에서는 항산화 활성이 저조했던 헥산(hexane) 및 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 분획물에서 $10\;{\mu}g/mL$ 시료농도를 기준으로 할 때, 50 % 이상의 NO 생성 억제율로 우수한 항염증 효능을 나타내었다. 특히, 위와 동일 실험 조건에서 헥산 분획물의 경우, 염증 반응 인자인 TNF-$\alpha$, IL-$1{\beta}$, IL-6 등의 cytokine과 iNOS, COX-2 효소의 발현이 농도의존적으로 억제됨을 RT-PCR 방법으로 확인할 수 있었다. 이번 연구 결과들로부터 가막살나무 유래 천연화학성분들은 자극완화용 화장품 소재 개발에 매우 유리하게 응용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

• Journal of Chest Surgery
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• 제34권6호
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• pp.447-453
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• 2001

배경: 연부조직 육종의 폐전이의 표준치료법은 폐절제술이지만, 대부분의 폐전이육종은 항암제 투여를 필요로 한다. 항암제 투여는 치료용량에 도달하기전에 발생하는 전신독성으로 인하여 그 효과가 만족스럽지 않다. 연부조직 육종의 항암제로 많이 사용하는 doxorubicin을 폐조직에 직접 투여하면 전신투여시에 비하여 전신독성이 적을 뿐만 아니라 폐에서 10~25배 높은 doxorubicin 농도를 얻을 수 있다. 그러나 이와 같은 고농도 doxorubicin의 암세포에 대한 효과에 대해서는 불명확하다. 대상 및 방법: 본 연구는 methylcholanthrene유도 섬유육종세포주(methylcholanthrene-induced rat fibrosarcoma cell line, MCA 세포)를 여러 농도의 doxorubicin에 24시간 노출한 후 세포독성과 자멸사(apoptosis) 유전자(Fas, FasL, Bax, caspase 1, caspase 2, caspase 8, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xS) 발현을 살펴보았다. 결과: MCA 세포에 대한 doxorubicin(1-100 $\mu$M)의 세포독성은 용량에 따라서 증가하였으나, 자멸사의 최고치는 5 $\mu$M의 doxorubicin에서 나타났다. 자멸사와 연관된 유전자의 모든 mRNA는 1 $\mu$M에서 대조군에 비해 증가한 후 doxorubicin의 용량이 증가함에 따라 감소하였는데, caspase 8은 5 $\mu$M의 doxorubicin에서도 대조군보다 높은 수치를 보였다. 자멸사와 연관된 단백질은 1 $\mu$M의 doxorubicin에서 가장 높은 수치를 나타낸 후 doxorubicin의 용량이 증가함에 따라 감소하였으나 Bax와 Bcl-xL 단백질은 모든 용량의 doxorubicin에서 대조군과 같거나 높은 수준을 보였다. 결론: 결론적으로 저농도(1-5 $\mu$M)의 doxorubicin에서 자멸사는 MCA세포를 사멸시키는 주된 작용기전이고, 이때에 자멸사와 연관된 유전자 인 Bax, caspase 8, Bcl-xL이 관여되는 것으로 보이며, 그보다 높은 농도의 doxorubicin에서는 자멸사는 억제되지만 MCA 세포에 대한 강력한 세포독성을 보여, 자멸사 이외의 다른 기전이 기여할 것으로 생각된다.

• 한국식품과학회지
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• 제50권4호
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• pp.420-429
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• 2018

본 연구에서는 식용 어류로부터 얻은 콜라겐을 효소 처리하여 글라이신-프롤린-하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp, GPH)과 같은 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 얻었고, 이 저분자 콜라겐 가수분해물(이하 콜라겐 트리펩타이드)의 피부 보습효과를 생체 외 실험(in vitro)과 생체 내 실험(in vivo)을 설계하여 증명하고자 하였다. 사람의 피부 섬유아세포 HDF 세포를 자외선 조사를 통해 인위적으로 손상된 세포를 만든 후, 콜라겐 트리펩타이드가 이를 회복시키는 정도를 몇 가지 보습인자의 활성과 발현량으로 확인하였다. Ceramide kinase의 효소활성은 콜라겐 트리펩타이드의 농도에 의존적으로 증가하였고, hyaluronic acid의 농도 역시 유의적으로 증가하였다. 더불어 히알루론산을 합성하는 유전자인 HAS2의 mRNA와 단백질 발현량이 시료의 처리양에 비례하여 증가하였고, 히알루론산을 분해하는 효소인 HYAL1의 수준은 콜라겐 트리펩다이드의 농도에 의존적으로 감소하였다. 상기의 효과는 1형 콜라겐을 합성하는 Collagen 1A 유전자의 단백질 발현량과 피부염증과 종양발생 시 증가한다고 알려진 CD44의 발현량의 확인으로 증명되었다. 유기용매의 도포로 피부건조를 유도한 동물모델을 사용하여 콜라겐 트리펩타이드의 피부에의 유효성을 평가하기 위해 경피수분손실량(TEWL)와 수분함유량을 직접적으로 측정한 바, 콜라겐 트리펩타이드 34 mg/kg bw의 고용량 처리군에서 가장 긍정적인 변화가 확인되었으나 17 mg/kg bw의 콜라겐 트리펩타이드 처리군에서도 수분함량에서 유의적인 변화가 관찰되었다. 이는 피부 건조로 유도된 가려움증에 대하여 동물이 자신의 몸을 긁는 행위를 계수한 결과와 같은 양상을 보였다. 또한 피부가 건조할 시 유도될 수 있는 염증인자인 $TNF-{\alpha}$와 IL-6의 단백질 발현량을 동물 피부 조직을 적출하여 확인하였고, 염색법을 통하여 피부 진피 내 탄력섬유의 변화를 가시적으로 제시하였다. 이 피부 조직에서의 Collagen 1A와 AQP3의 단백질 발현량 및 세라마이드 키나이제, HAS2, 그리고 HYAL1 효소활성 결과는 상기의 누적된 콜라겐 트리펩타이드의 보습 효과를 더불어 증명하여 주었다. 이상의 결과로부터 본 연구의 저자는 콜라겐 트리펩타이드가 피부 보습에 효능을 갖는 소재로서 활용가치가 높음을 알 수 있었으며, 현재 시장에서 유통되고 있는 분자량 1000 Da 이상의 콜라겐 가수분해물보다도 저분자화 되며 트리펩타이드를 다량 함유하는 상기의 소재가 증명된 유효성과 증가된 체내 흡수도에 근거하여 보다 확장된 가능성을 보여줄 수 있을 것이라 판단된다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제31권2호
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• pp.113-118
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• 2016

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) 유전자는 주로 간에서 분비되며 저밀도지단백질 수용체(LDLR)와 결합체를 이루어 세포 내 저밀도지단백질 수용체를 약화시킴에 따라 저밀도지단백질(LDL) 흡수를 감소시킨다. PCSK9은 심혈관 질환 및 상염색체 우성 가족성 고콜레스테롤혈증과 깊은 연관성을 나타내며 발병 메커니즘을 조절하는 주요한 인자로서 치료제 개발을 위해 많은 연구가 진행 중에 있다. 하지만 생식계통 내에서 PCSK9의 발현 및 기능에 대한 연구가 미비한 현실이다. 이에 본 연구에서는 고 콜레스테롤 식이에 따라 수컷 랫드의 생식기관 (음경, 전립선, 정소) 내 Pcsk9의 발현 변화를 확인하고자 한다. 과도한 콜레스테롤의 축적으로 인한 이상지질혈증은 수컷 랫드의 생식기능장애와 내분비교란을 유발하지만 이를 일으키는 조절 인자와 메커니즘은 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구진의 선행연구에서는 고 콜레스테롤 식이에 의해 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도지단백질 콜레스테롤 레벨이 증가 및 고밀도지단백질(HDL) 콜레스테롤의 감소를 확인하였다. 이 후, Pcsk9의 mRNA 발현은 음경 조직 내에서 80% 감소하는 것으로 나타났고 그 발현은 주로 발기 조직인 음경해면체 및 요도해면체 내 요도상피세포에서 주를 이룸을 확인하였다. 또한 Pcsk9은 고콜레스테롤 식이에 의해 발생하는 전립선 비대증 조직 내에서 20% 감소하는 것으로 나타났다. 그리고 마지막으로 Pcsk9은 고 콜레스테롤 식이를 섭취한 랫드의 정소 조직내에서 정상 정소 조직에 비해 약 28% 감소하였으며 정자발생에 주요한 정세관 내 정원세포, 정모세포, 정세포에서 그 발현이 확인되었다. 본 연구결과를 통해 Pcsk9 유전자가 수컷 랫드 생식기관 (음경, 전립선, 정소)에서 고콜레스테롤 식이에 의해 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, 이는 Pcsk9이 남성 생식기관의 성장 및 발달 메커니즘에 중요한 역할을 미칠 것으로 사료된다.

• Radiation Oncology Journal
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• 제17권4호
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• pp.299-306
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• 1999

목 적 : Ataxia-Telangiectasia (AT) 증은 여러 가지 유전적 결함을 갖는 질병으로 방사선 민감도가 비정상적으로 상승되어 있는 것이 특징이다 AT 환자에서 공통적으로 존재하는 ATM 유전자는 현재까지 방사선 신호전달에 관여하는 것으로 알려진 Pl-3 kinase와 유사한 구조임이 알려져 ATM이 방사선 신호전달경로에 중요한 작용을 할 것으로 추정하게 되었다. 본 연구에서는 AT 세포와 정상세포에 PKCI를 과발현 시킴으로써 방사선 신호전달에 관여하는 PKC를 억제하여 이것이 방사선 민감도에 미치는 영향을 관찰하고, 방사선에 의해 유도되는 early response gene인 c-fos transcription의 차이를 측정하여 ATM과 PKCI에 의한 신호전달이 c-fos 유전자 전사에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 대상 및 방법 : PKCI expression vector를 작제한 후 정상세포인 LM217과 AT세포인 AT5BIVA에 transfection 시킨 후 plasmid의 genomic DNA에 결합된 것은 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 확인하였고 PKCI의 mRNA 발현 여부는 northern blotting으로 확인하였다. 방사선 민감도는 아포토시스로 측정하였으며 PKCI가 과발현된 각 세포주에 5 Gy의 방사선을 조사한 후 48시간에 세포를 모아 TUNEL방법으로 아포토시스 세포의 수를 측정하였다. c-fos 유전자의 전사는 reporter 유전자로 c-fos CAT plsmid를 $\beta$-gal expression vector와 같이 각 세포주에 transfection 시키고 36시간이 지난 후 CAT assay를 하여 activity를 측정하고 동시에 $\beta$-gal assay를 시행하여 transfection 효율을 보정해 주었다. PKCI, Ras의 영향을 보기 위하여는 PKCI, Ras expression vector와 c-fos CAT plasmid를 cotransfection하고 CAT activity로 측정 하였다. 결 과 : 이 실험의 결과 LM과 AT 세포에서 PKCI가 방사선 민감도에 미치는 영향과 c-fos 전사에 미치는 영향을 처음으로 보여주었다. PKCI의 과발현이 LM 세포에서는 방사선 민감도를 증가시켰지만 AT세포에서는 오히려 약간 감소시키는 작용을 나타내었다. c-fos 전사는 AT 세포에서 LM 세포에 비하여 70배 낮게 나타났는데 PKCI가 과발현 됨으로써 LM 에서는 c-fos의 전사가 감소되었지만 AT 세포에서는 영향이 없었다. Ras 단백으로 c-fos를 유도시키고 여기에 PKCI 발현 백터를 contransfection 하면 LM세포에서는 induction 이 감소되었지만 AT 세포에서는 영향이 없었다. 즉 LM과 AT 세포에서의 PKCI에 의한 반응의 차이는 Ras와 관련된 signal transduction pathway라는 것을 알 수 있었다. 결 론 : PKCI는 정상세포에서는 방사선에 의한 세포 손상을 증가시키지만 AT 세포에서는 별 영향을 보이지 않는 것을 알 수 있었으며, 두 세포간의 이러한 차이는 c-fos proto-oncogene의 전사차이로 설명할 수 있겠다. 이러한 차이가 AT 세포의 방사선 민감도의 한 원인일 것으로 생각된다.