It has been found that a number of diseases are associated with mutations in the mitochondrial DNA. Therapeutic gene delivery to mitochondria has been suggested as a clinical option for these diseases. In this study, we developed a gene carrier to mitochondria by the conjugation of mitochondrial leader peptide (LP) to polyethylenimine (PEI). Mitochondrial LP conjugated PEI (PEI-LP) was synthesized with low molecular weight PEI (2,000 Da, PEI2K). Gel retardation assay showed that PEI2K-LP formed complexes at a 1.0/1 weight ratio. In addition, PEI2K-LP protected DNA from the enzymatic degradation for at least 60 min, while naked DNA was completely degraded within 20 min. PEI2K-LP was compared with LP conjugated high molecular weight PEI (25,000 Da, PEI25K) in terms of toxicity and delivery efficiency. MTT assay showed that PEI2K-LP had much lower cytotoxicity than PEI25K-LP to 293 cells. In addition, cell-free DNA delivery assay showed that PEI2K-LP delivered more DNA to mitochondria at a 1.8/1 weight ratio than naked DNA or PEI. This result suggests that PEI2K-LP may be useful for the development of mitochondrial gene therapy system with lower cytotoxicity.
유도된 집파리유통 hemolymph중에서 Candida albicans의 3가지 anti-fungal peptides를 분리하였다. 3개 anti-fungal peptides는 분자량이 4-16 kDa 사이의 분명한 구별이 있을 뿐만 아니라, 각 peptide는 anti-fungal peptides작용이 있었다. 이들 peptide의 공통 특징은 모두 열을 받은 뒤 활성이 변하지 않는 비교적 강한 내열성을 보여주었다.
본 연구는 김의 Maxazyme NNP 가수분해물로부터 여러 단계의 column chromatography 및 HPLC를 통해 ACE 저해 peptide를 분리, 정제하여 이의 분자량과 amino acid sequence를 분석하였다. ACE 저해 효과가 큰 저분자 peptide의 함량이 많은 가수분해물을 얻기 위한 최적의 단백질 가수분해 효소를 선정하기 위하여 시험한 결과, Maxazyme NNP에 의한 가수분해물의 ACE 저해효과가 $37.2\%$로 가장 높게 나타났다 김의 효소 가수분해물로부터ACE 저해 peptide만을 효율적으로 분리하기 위한 추출 조건 시험에서, 색소 제거를 위해서는 diethylether 처리가, 다당류 및 고분자 단백질 제거를 위해서는 $70\%$ ethanol 처리가 각각 선정되었다. 김 가수분해물로부터 ACE 저해 peptide를 분리, 정제하기 위한 첫 단계로 ultrafiltration을 한 결과, 분자량 3,000 이하 분획물의 ACE 저해 효과가 $69.4\%$로 가장 높았으며, 이 분획물을 gel filtration chromatography (Sephadex G-25) , reverse-phase HPLC (ODS & Vydac C-18) 및 gel permeation chromatography (Superdex Peptide HR)와 같은 단계별 column chromatography를 행하여 최종적으로 단일 peptide peak들을 분리하였다. 이들 단일 peptide peak들의 분자량을 Electrospray-Mass Spectrometer로 측정한 결과, 각각 413.48 (S1O2V2V1P),346.86 (S1O2V2V2P) 그리고 320.32 (S2O6V3V1P) dalton이었으며, 이들 peptide의 amino acid sequence는 N-말단으로부터 아미노산 잔기를 분석한 결과, 각각 Val-Gln-Gly-Asn, Thr-Glu-Thr 및 Phe-Arg으로 확인되었다.
된장의 맛성분에 크게 기여할 것으로 보이는 펩타이드의 분리를 통해 된장의 수용도를 높이는 자료를 제공하고자 개량식 제조 된장에서 펩타이드의 특성을 연구한 결과 ,된장 숙성중에 단백질의 분해로 생성되는 pe-ptide는 숙성에 따라 그 길이가 짧아져 A.p.L.(average peptide length)는 숙성 0일에 102에서 10일에는 15로 급격히 줄었고 20일에 7.9, 숙성 60일에는 4.9.E, 180일에는 4.1로 나타났다. HPLC로 분리한 펩타이드는 숙성 60일과 180일 분획이 거의 비슷하여 저분자량의 펩타이드는 숙성에 따른 변화가 크지 않음을 알 수 있었고 확인된 저분자량의 펩타이드는 Gly-Glu, Ala-Ser, Glu-ser, Asp-Tyr, Asp-Glu, Glu-Ser-Ala, Asp-Ala-Ser, Ala-ser-Glu, Ala-Lys-Met이었다. 180일 숙성시킨 시료에서 쓴맛 펩타이드의 특성을 알아보기 위해 chloroform-me-thanol에 추출한 '용매추출 분획1'을 겔 크로마토그라피 한 결과 세개의 피크로 나뉘어 졌는데 fraction I과 ll는 쓴맛을 나타내었고 이들의 아마노산 조성은 각각 Glu-(Asp, Pro, Val, lie or Leu)-Met와 Pro-(Glu, Val, Phe)-lie or Leu인 것으로 나타났다. Chloroform-methanol 불용성인 잔사를 물에 녹인 뒤 분자량 1200이하의 것을 투석시켜 얻은 '용매추출 분획2'는 겔크로마토그칵피 결과 다섯개의 피크로 나뉘어 졌고 여기서 쓴맛을 내는 fraction IV, V, Vl의 아미노산 조성은 각각 Glu-(Asp, Ala, Tyr, Leu or lie)-Phe와 hia-(Met, Glu, Ala, Pro)-lie or Leu와 Asp-(Phe, Ser, Gly)-Val이었다.
A positional scanning synthetic peptide combinatorial library (PS-SCL) was screened in order to identify antimicrobial peptides against the cariogenic oral bacteria, Streptococcus mutans. Activity against Streptococcus gordonii and Aggregatibacter actinomycetemcomitans was also examined. The library was comprised of six sub-libraries with the format $O_{(1-6)}XXXXX-NH_2$, where O represents one of 19 amino acids (excluding cysteine) and X represents equimolar mixture of these. Each sub-library was tested for antimicrobial activity against S. mutans and evaluated for antimicrobial activity against S. gordonii and A. actinomycetemcomitans. The effect of peptides was observed using transmission electron microscopy (TEM). Two semi-mixture peptides, RXXXXN-$NH_2$ (pep-1) and WXXXXN-$NH_2$ (pep-2), and one positioned peptide, RRRWRN-$NH_2$ (pep-3), were identified. Pep-1 and pep-2 showed significant antimicrobial activity against Gram positive bacteria (S. mutans and S. gordonii), but not against Gram negative bacteria (A. actinomycetemcomitans). However, pep-3 showed very low antimicrobial activity against all three bacteria. Pep-3 did not form an amphiphilic ${\alpha}$-helix, which is a required structure for most antimicrobial peptides. Pep-1 and pep-2 were able to disrupt the membrane of S. mutans. Small libraries of biochemically-constrained peptides can be used to generate antimicrobial peptides against S. mutans and other oral microbes. Peptides derived from such libraries may be candidate antimicrobial agents for the treatment of oral microorganisms.
This study was carried out to investigate the optimun conditions for the isolation of low molecular weight peptides containing histidine, and to evaluate the antioxidant effects of skipjack boiled extracts(SBE). The results are summarized as follows : L-histidine contents of the ordinary muscle and dark muscle extracts were $ 83.1{\pm}1.75{\mu}M/g\;and\;11.0{\pm}2.39\;{\mu}M/g$, respectively. The L-histidine level of the dark muscle was much lower than that of ordinary muscle in the SBE. The extracts were treated with alcalase and neutrase under different pH levels, temperatures, and times. The optimum hydrolysis conditions of SBE were pH 7.0 and a $60^{\circ}$C temperature for 2 hr in the batch reactor, which hydrolyzed 63% of the SBE. HPLC analysis showed a removing effect of the ultrafiltration permeate (UFP) to high molecular weight impurities in SBE. SBE and pure carnosine participated as inhibiting agents to, which was confirmed through the autoxidation processing of linoleic acid. UFP treatment improved the inhibiting ability of SBE to the autoxidation of linoleic acid. The reducing power of the UFP-treated ordinary muscle extracts were 10-fold higher than the dark muscle extracts, and 0.7-fold higher than 20 mM pure carnosine. The UFP-treated ordinary muscle extracts had greater reducing power activity than pure carnosine. The scavenging activities on DPPH radical of the different treated-SBE and pure carnosine were also investigated. Scavenging activities of the ordinary and dark muscle extracts and the pure carnosine were 90%, 70%, and 45%, respectively. In summary, Skipjack boiled extracts (SBE) demonstrated that low molecular weight peptides containing histidine are capable of inhibiting lipid oxidation. They also possessed effective abilities as free radical scavengers and reducing agents, and these activities may increase with increasing concentrations.
Apolipoprotein B-100 (Apo-B100) is a major component of low density lipoprotein (LDL). Apo B-100 protein has 4,536 amino acid sequence and these amino acids are classified into peptide groups A to G with subsequent 20 amino acids (P1-P302). The peptide groups were act as immunoglobulin (Ig) antigens which oxidized via malondialdehyde (MDA). The mimetic peptide P1 (EEEMLENVSLVCPKDAT RFK) out of D-group peptides carrying the highest value of IgG antigens were selected for structural studies that may provide antigen specificity. Circular Dichroism (CD) spectra were measured for peptide secondary structure in the range of 190-250 nm. Experimental results show that P1 exhibit partial of ${\beta}-sheet$ and random coil structure. Homonuclear (COSY, TOCSY, NOESY) 2D-NMR experiments were carried out for NMR signal assignments and structure determination for P1. On the basis of these completely assigned NMR spectra and distance data, distance geometry (DG) and Molecular dynamics (MD) were carried out to determine the structures of P1. The proposed structure was selected by comparisons between experimental NOE spectra and back calculated 2D NOE results from determined structure showing acceptable agreement. The total Root-Mean-Square-Deviation (RMSD) value of P1 obtained upon superposition of all atoms was in the range $0.33{\AA}$. The solution state P1 has mixed structure of ${\beta}-sheet$ (Glu[1] to Cys[12]) and random coil (Pro[13] to Lys[20]). These NMR results are well consistent with secondary structure from experimental results of circular dichroism. Structural studies based on NMR may contribute to the studies of atherosclerosis and observed conformational characteristics of apo B-100 in LDL using monoclonal antibodies.
In the previous report (Choi et al., 1997), the angiogenin binding peptides identified from a phage-peptide library were analyzed by using the fusion proteins composed of the Escherichia coli maltose binding protein and its corresponding peptides. However, it was difficult to obtain a sufficient amount of the fusion proteins required for further analysis because of the low expression level. We now report a high level expression of the fusion protein and analysis of its anti-angiogenin activity. The use of strong T7 promoter and removal of signal sequence allowed about a 20-fold increase in the expression efficiency of the fusion protein. We were able to obtain about 10 mg of purified fusion protein from one liter of culture. The purified fusion protein showed angiogenin-specific affinity and inhibited the binding of biotinylated actin to human angiogenin at $IC_{50}$ of 0.6 mM. Its anti-angiogenin activity was also revealed by the chorioallantoic membrane assay.
Current influenza vaccines are produced in embryonated chicken eggs. However, egg-based vaccines have various problems. To address these problems, recombinant protein vaccines have been developed as new vaccine candidates. Unfortunately, recombinant proteins frequently encounter aggregation and low stability during their biogenesis. It has been previously demonstrated that recombinantly expressed proteins can be greatly stabilized with high solubility by fusing stabilizing peptide (SP) derived from the C-terminal acidic tail of human synuclein (ATS). To investigate whether SP fusion proteins can induce protective immunity in mice, we produced influenza HA and SP fusion protein using a baculovirus expression system. In in vitro tests, SP-fused recombinant HA1 (SP-rHA1) was shown to be more stable than recombinant HA1 (rHA1). Mice were immunized intramuscularly with baculovirus-expressed rHA1 protein or SP-rHA1 protein ($2{\mu}g/mouse$) formulated with aluminum hydroxide. Antibody responses were determined by ELISA and hemagglutination inhibition assay. We observed that SP-rHA1 immunization elicited HA-specific antibody responses that were comparable to rHA1 immunization. These results indicate that fusion of SP to rHA1 does not negatively affect the immunogenicity of the vaccine candidate. Therefore, it is possible to apply SP fusion technology to develop stable recombinant protein vaccines with high solubility.
Antagonists of the d -opioid receptor are effective in overcoming resistance against analgesic drugs such as morphine. To identify novel antagonists of the d -opioid receptor that display high potency and low resistance, we performed 3D-QSAR analysis using chemical feature-based pharmacophore models. Chemical features for d -opioid receptor antagonists were generated using quantitative (Catalyst/HypoGen) and qualitative (Catalyst/HipHop) approaches. For HypoGen analysis, we collected 16 peptide and 16 non-peptide antagonists as the training set. The best-fit pharmacophore hypotheses of the two antagonist models comprised identical features, including a hydrophobic aromatic (HAR), a hydrophobic (HY), and a positive ionizable (PI) function. The training set of the HipHop model was constructed with three launched opioid drugs. The best hypothesis from HipHop included four features: an HAR, an HY, a hydrogen bond donor (HBD), and a PI function. Based on these results, we confirm that HY, HAR and PI features are essential for effective antagonism of the d -opioid receptor, and determine the appropriate pharmacophore to design such antagonists.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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