• Journal of Plant Biotechnology
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• 제3권1호
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• pp.39-44
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• 2001

Plastid transformation was attempted with soybean [Glycine max (L.) Merr.] leaves and photoautotrophic and embryogenic cultures by particle bombardment using the transforming vector pZVII that carries the coding sequences for both subunits of Chlamydomonas reinhardtii Rubisco and a spectinomycin resistance gene (aadA). Spectinomycin resistant calli were selected from the bombarded leaves but the transgene was not present, indicating that the resistance was due to mutations. The Chlamydomonas rbcL and rbcS genes were shown to be site-specifically integrated into the plastid genome of the embryogenic cells with a very low transformation efficiency. None of the transformed embryogenic lines survived the plant regeneration process so no whole plants were recovered. This result does indicate that it should be possible to insert genes into the plastid genome of the important crop soybean if the overall methods are improved.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제2권2호
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• pp.109-113
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• 2000

Somatic hybrids were produced by electrofusion between embryogenic callus protoplasts of 'Syougun' mandarin and leaf protoplasts of grapefruit. Hybridity of the two plants was confirmed by leaf morphological characteristics and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. The cpDNA analysis using PCR-RFLP could not distinguish those of both parents. These plants showed normal growth and had chromosome number of 27. These unexpected triploid somatic hybrids might be derived from fused cells between diaploid protoplast of embryogenic calli and diploid protoplast of leaf, because polysomaty, a mixture of haploid cells and diploid cells was observed in the lactose medium-pretreated embryogenic calli of 'Syougun' by flow cytomehy analysis.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제11권1호
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• pp.38-42
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• 2006

When whole cells are subjected to pyrolysis gas chromatography/mass spectrometry (Py-GC/MS) analysis, it provides biochemical profiles containing overlapping signals of the majority of compounds. To determine marker compounds that discriminate embryogenic calluses from nonembryogenic calluses, samples of embryogenic and nonembryogenic calluses of five higher plant species were subjected to Py-GC/MS. Genetic programming of Py-GC/MS data was able to discriminate embryogenic calluses from nonembryogenic calluses. The content ratio of 5-meyhyl-2-furancarboxaldehyde and 5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxaldehyde was greater in nonembryogenic calluses than in embryogenic calluses. However, the content ratio of phenol, p-cresol, and $^1H-indole$ in embryogenic calluses was 1.2 to 2.4 times greater than the ratio in nonembryogenic calluses. These pyrolysates seem to be derived from the components of the cell walls, which suggests that differences in cell wall components or changes in the architecture of the cell wall playa crucial role in determining the embryogenic competence of calluses.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권1호
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• pp.13-19
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• 1998

Electroporation을 이용한 형질전환 연구에서 원형질체 대신 체세포 배발생 세포를 이용하여도 DNA가 도입될 수 있음을 이미 보고한 바 있다. 본 연구는 배발생 세포 내로 DNA를 도입하기 위한 electroporation의 최적 조건, 즉 전압과 capacitance 수준, promoter 종류, DNA 농도, 저온처리효과 등을 구명하며, 처리에 따른 DNA의 전입 현상을 이해하고 전기충격후의 생장과 분화 정도를 조사하고자 수행되었다. 들잔디 미숙배를 2,4-D가 2 mg/L 함유된 MS배지에서 배양하여 배발생 캘러스를 유도하였고, 동일 조성의 액체배지에 진탕배양하여 조직 electroporation에 적합한 현탁배양 세포괴를 증식할 수 있었다. 100-400 V의 전압과 10-1980 $\mu\textrm{F}$의 capacitance 수준에서 세포괴를 35S-gusA 조성을 갖는 운반체 DNA와 함께 electroporation 하였을 때, 전반적으로 DNA가 도입되었음을 표지유전자 gusA의 transient 발현을 통하여 확인하였으며, 200-300 V 전압과 330-800 $\mu\textrm{F}$ capacitance 수준이 보다 효과적인 경향을 보였다. 처리시 온도는 큰 영향을 미치지 않았으며, 6 $\mu\textrm{g}$/mL 이상의 DNA 농도에서는 GUS 발현이 양호하였다. 배발생 캘러스 세포주들은 모두 DNA가 도입 되었으나 비 배발생 캘러스 세포주는 11개중 하나에서만 도입이 확인되었다. Electroporation시 전기충격후 20, 40시간 후에 DNA를 첨가하여도 gusA가 발현됨에 따라 전기충격이 세포막의 침투성을 장시간 변화시킴으로써 DNA가 전이될 수 있는 것임을 확인할 수 있었다. GusA의 promoter로 CaMV 35S외에 Actl과 Ubil의 활성을 비교한 바, 35S에 비해 각각 7배, 5배의 활성을 나타내었다. Electroporation 처리후 세포괴의 배양실험에서 100-400 V의 전압과 10-l980 $\mu\textrm{F}$ capacitance의 전 처리 범위에서 캘러스의 지속적인 생장과 함께 식물체 재분화가 일어났다.

• Journal of Plant Biology
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• 제32권4호
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• pp.227-233
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• 1989

Single cells obtained from suspension culture of mature embryo-derived callus in wheat(Triticum aestivum L. cv Jang Kwang) were cultured to regenrated into the plantlet. Cell clusters and embryogenic calluses were efficiently developed from when the single cells clutured on the MS medium supplemented with 10${\mu}{\textrm}{m}$ 2,4-D. Upon transfer to hormone-free MS medium containing 10 mg/I AgNO3, embryogenic calluses gave rise to shoots, probably through somatic embryogenesis.

• 식물조직배양학회지
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• 제26권2호
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• pp.121-126
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• 1999

참나물 (Pimpinella brachycarpa)의 엽병 (petiole)절편체로부터 캘러스가 MS배지 (0.5mg/L 2,4-D와 0.1mg/L BAP)에서 유도되었으며 이들 캘러스로부터 치밀하게 배열된 세포집단(cell cluster)을 선발하여 현탁배양하였다. 이들 현탁배양세포들은 0.1 mg/L NAA가 포함된 MS고체배지에 배양되어 배발생 (embryogenic) 캘러스로 성장하였다. 배발생캘러스는 연한 노란색을 띠며 체세포배로 분화되었으며 이들 체세포배는 MS액체배지에서 발아되어 식물체로 성장하였다. 참나물 현탁배양세포 유래 배발생캘러스로부터 분리한 mRNA로부터 cDNA library를 합성하여 PCR을 수행한 결과 제조된 library의 삽입절편의 크기가 대부분 500bp이상임을 확인하였다. 이들 cDNA library로부터 전체 1.5 $\times$$10^{6}$개의 plaque를 혼성화하여 일차의 screening을 통해 19개의 cDNA clone을, 이차의 screening을 통해 5개의 cDNA clone을 얻었으며 이중 4개의 cDNA clone은 참나물 shoot의 HD-Zip 유전자인 Phz4 유전자와 동일한 약 1.4 kb 정도인 것으로 나타났으나, 1개의 cDNA clone, Phc5는 약 1.5kb정도의 크기를 나타내었다. 1.5kb인 Phc5는 Phz4유전자의 5'쪽으로 163bp의 염기가 추가로 발견되어 총 1,531 bp에 해당하였으며 18개의 polyA tail을 가지고 있었다. Phc5는 284번째에 ATG개시코돈이 있고 302개의 아미노산을 암호화하는 906개의 단백질 암호화 부위와 Homeodomain을 갖고 있었다. Phc5로부터 추정된 단백질은 기존 전사조절자에서 많이 보고된 HD의 구조적 특징을 갖고 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제21권5호
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• pp.309-314
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• 1994

간편하면서도 효율적인 단자엽 식물의 형질전환 기법을 개발하기 위하여 배발생 세포를 직접 electroporation하여 DNA를 도입하는 실험을 벼와 잔디에서 실시하였다. 잔디는 수정 후 3주된 미숙배에서 캘러스를 유도하였으며, 2.4-D가 1 mg/L 함유된 액체 MS배지로 옮겨 진탕배양한 것을 electroporation 실험에 이용하였다. 벼는 20 mm 정도의 미숙화서 유래의 캘러스를 액체 N$_{6}$배지(1 mg/L 2.4-D 함유)에서 진탕배양하여 획득한 세포주를 사용하였다. 액체 진탕배양한 세포괴를 GUS expression vector인 pGA1074 (30 $\mu\textrm{g}$/ml)와 함께 MS 액체 배지에서 Electroporation하였다. 세포벽과 세포막을 통한 세포로의 DNA 전이는 GUS 유전자의 발현 여부 및 정도에 따라 결정하였다. 400 volt, 800 $\mu$F capacitance로 electroporation 처리된 벼와 잔디의 세포괴들은 200 ${\mu}\ell$ (packed cell volume)의 세포괴 당 25 unit (1 unit=파란색을 띤 독립된 세포군) 이상의 빈도로 GUS 활성을 나타내었다. 반면에 무처리 세포주 및 처리한 비배발생 세포주에서는 GUS 발현이 일어나지 않음을 반복적으로 확인차였다. 따라서 electroporation에 의한 벼와 잔디의 형질전환실험에서 원형질체 대신 intact한 배발생 세포가 이용될 수 있음을 의미한다

• 식물조직배양학회지
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• 제27권2호
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• pp.149-154
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• 2000

땅두릅 미성숙 화기절편을 이용하여 1 mg/L 2,4-D의 고체배지에서 배발생 캘러스를 유도하였고 동일조건의 액체배지에서 증식시켰다. 배발생 세포를 270$\mu\textrm{m}$의 걸름체로 거른 다음 배발생 세포는 싸이토카이닌이 포함된 MS 액체배지에서 2주 동안 배양하였고 그후 생장조절물질이 없는 MS 액체배지에서 5주간 배양하여 1차 체세포배가 유도되었다. 이들중 어뢰형과 자엽형 시기의 배를 생장조절물질이 없는 MS고체 배지에 치상하였을 때 캘러스의 형성 없이 2차배가 직접 유도되었다. 2차배를 유도할 때 2mg/L kinetin에서 얻어진 1차 배에서 가장 높은 빈도의 2차배가 발생되었다. 식물체 재생은 1 mg/L kinetin 혹은 1 mg/L zeatin을 처리하여 얻어진 1차 자엽형배로부터 유도된 2차 자엽형배를 생장조절물질이 없는 MS 고체배지에 치상하였을 때 높게 나타났다 (각각 25.4%, 28.6%). 2차배로부터의 3차배 발생과 식물체 재생과의 상관 관계를 볼 때 식물체의 재생에 있어서 3차배의 배발생은 저해적인 영향을 주었다.

• Journal of Forest and Environmental Science
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• 제23권1호
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• pp.5-9
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• 2007

Zygotic embryos just after harvest of seeds were immature globular to heart stage. Maturation of zygotic embryos rapidly proceed when zygotic embryos together with small excised parts of endosperm were cultured on 1/3-strength MS solid medium with 2% sucrose, and the zygotic embryos were germinated within two months. Embryogenic callus was formed from the excised segments of germinating zygotic embryos of Eleutherococcus pedunclus on Murashige and Skoog (MS) medium with $4.5{\mu}M$ 2,4-D. The embryogenic callus formation occurred at a low frequency (less than 7%) from hypocotyl segments. The embryogenic calli were maintained on the same medium as primary medium. High frequency somatic embryogenesis was obtained after the cells were transferred to medium lacking 2,4-D. Cotyledonary embryos were germinated and converted into plantlets on medium with $20{\mu}M$ $GA_3$. Embryogenic callus and somatic embryos were produced spontaneously on the surfaces of roots and/or hypocotyls of plantlets. The frequency of embryogenic callus formation was 85% in roots and 34% in hypocotyls. Therefore maintain of cell lines performed very easily. Plantlets with developed epicotyls at more than 3 cm acclimatized at high frequency (89%). While plantlets with small epicotyls (less than 1 cm) were acclimatized at low rate (32%). The soil survived plantlets produced new sprouts after over wintering in the field.

• 한국자원식물학회지
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• 제8권3호
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• pp.237-246
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• 1995

본 연구에서는 유자의 미성숙 배로부터 캘러스 유도와 재분화 및 발생단게별 미세구조적 특성에 관하여 연구하였다. 유자에서는 배양 5-6주 경에 담황색의 캘러스가 유도되었으며, 배양 6주경의 캘러스 세포에서는 인접하고 있는 작은 액포들이 융합하여 큰 액포를 형성하는 융합현상을 관찰하였다. 배양 12주 경에는 배발생 캘러스의 미분화 세포에서 특이하게 구형의 핵인을 가지고 있는 큰핵과 녹말로 가득차 있는 녹말체를 다수 관찰하였다. 배양 14-16주 경의 배발생 캘러스 세포에서는 활발하게 exocytosis가 일어나므로서 다수의 분배체들이 세포벽쪽에서 관찰되었으며 세포질로부터 작은 입자들이 세포 간극으로 빠져나가는 것을 볼수 있었다. 또한 배양 24주경의 배발생 캘러스에서는 발달된 커다란 구형의 엽록체들이 이중막으로 세포질과 경계되어 있었으며 기질중에 일정하게 전형적인 그라나가 분포되어 있었다. 배양 26주경의 어린 정상 식물체의 미성숙잎에서는 다수의 도관과 반세포들이 관찰되었다. 배양 30주경의 정상식물체의 미성숙잎에는 다수의 작은 반세포들과 사관 그리고 중심액포들이 나타났으며 또한 작은 제2차 액포들이 커다란 중심 액포 속으로 끼어들어가는 현상을 볼 수 있었으며 원형질막 근처에는 신장된 엽록체들이 분포되어 있었다.