• 미생물학회지
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• 제38권4호
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• pp.270-270
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• 2002

Pathogenic Salmonella typhimurium can invade the intestinal epithelium and cause a wide range of diseases including gastroenteritis and bacteremia in human and animals. To identify the genes involved in the infection, the invasion determinant was obtained from S. typhimurium 82/6915 and was subcloned into pGEM-7Z. A subclone DHl (pSV6235) invaded HEp-2 and Chinese hamster ovary epithelial cells and contained a 4.4 kb fragment of S. typhimurium genomic region. Compared with the host strain E. coli DHl, the subclone DHl (pSV6235) invaded cultured HEp-2 and Chinese hamster ovary cells at least 75- and 68-fold higher, respectively. The invasion rate of E. coli DHl for the cells significantly increased by harbouring the genomic region derived from pathogenic S. typhimurium 82/6915.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제11권6호
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• pp.510-515
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• 2006

The putative EPA synthesis gene cluster was mined from the entire genome sequence of Shewanella oneidensis MR-1. The gene cluster encodes a PKS-like pathway that consists of six open reading frames (ORFs): ORFSO1602 (multi-domain beta-ketoacyl synthase, KS-MAT-4ACPs-KR), ORFSO1600 (acyl transferase, AT), ORFSO1599 (multi-domain beta-ketoacyl synthase, KS-CLF-DH-DH), ORFSO1597 (enoyl reductase, ER), ORFSO1604 (phosphopentetheine transferase, PPT), and ORFSO1603 (transcriptional regulator). In order to prove involvement of the PKS-like machinery in EPA synthesis, a 20.195-kb DNA fragment containing the genes was amplified from S. oneidensis MR-1 by the long-PCR method. Its identity was confirmed by the methods of restriction enzyme site mapping and nested PCR of internal genes orfSO1597 and orfSO1604. The DNA fragment was cloned into Escherichia coli using cosmid vector SuperCos1 to form pCosEPA. Synthesis of EPA was observed in four E. coli clones harboring pCosEPA, of which the maximum yield was 0.689% of the total fatty acids in a clone designated 9704-23. The production yield of EPA in the E. coli clone was affected by cultivation temperature, showing maximum yield at $20^{\circ}C$ and no production at $30^{\circ}C$ or higher. In addition, production yield was inversely proportional to glucose concentration of the cultivation medium. From the above results, it was concluded that the PKS-like modules catalyze the synthesis of EPA. The synthetic process appears to be subject to regulatory mechanisms triggered by various environmental factors. This most likely occurs via the control of gene expression, protein stability, or enzyme activity.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제13권2호
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• pp.292-300
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• 2003

Pseudomonas fluorescens B16 is a plant glowth-prornoting rhizobacterium, which produces an antibacterial compound that is effective against plant root pathogens, such as Agrobacrerium tumefaciens and Raistonia solanacearum. We mutagenized the strain B16 with Omegon-Km and isolated six antibacterial-activity-deficient mutants. Two cosmid clones that hybridized with the mutant clones also were isolated from a genomic library of tile parent strain. Using deletion and complementation analyses, it was found that the biosynthesis genes resided in a 4.3-kb SalI-NarI fragment. When a plasmid clone carrying the fragment was introduced into P. fluorescens strain 1855.344, which does not exhibit any antibacterial activity, the transconjugants exhibited antibacterial activity, indicating that the plasmid clone carried all the genes essential for production of the antibacterial compound. DNA sequence analysis of the fragment identified four putative open reading frames (ORFs): orf1 through orf4 The deduced amino acid sequences of ORF1, ORF2, and ORF4 were similar to cystathionine gamma lyase, pyruvate formate-lyase activating enzyme, and transcriptional regulator, respectively, yet the amino acid sequence of ORF3 showed no similarities to any known proteins. It was also demonstrated that the antibacterial activity was responsible for biological control of the bacterial wilt caused by R. solanacearum.

• 생명과학회지
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• 제13권4호
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• pp.522-528
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• 2003

본 연구는 출아형 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 자외선의 상해 시 이를 정상으로 회복시키는 절제회복 (excision repair) 유전자로 알려진 RADA4의 특성 규명을 위하여 균류 Coprinus cinereus에서 이와 유사한 유전자를 분리하였다. RAD4 유사 유전자를 분리하기 위하여 균류 C. cinereus의 염색체 DNA를 전기영동하여 분리한 다음 효모 RAD4 DNA를 probe로하여 이와 hybridization하였다. 이 결과 RAD4 유사 유전자는 3.2 kb의 insert DNA를 갖고 있었다. 또한 Southern hybridization으로 이 유사 유전자는 fungus C. cinereus의 염색체에 존재함을 확인하였다. 분리한 RAD4 유사 유전자의 전사체 크기는 2.5 kb 였으며, 자외선의 상해 시 전혀 'inducibility가 없음을 Northern hybridization으로 확인하였다. 또한 유사유전자 부분을 삭제하였을 때 이 부분이 없는 세포는 전혀 생존을 못하였다. 이 결과 분리한 RAD4 유사유전자는 세포의 생존에 관여함을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제14권6호
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• pp.1023-1027
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• 2004

본 연구는 출아형 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 자외선의 상해 시 이를 정상으로 회복시키는 절제회복(excision repair) 유전자로 알려진 RADS의 특성 규명을 위하여 균류 Coprinus cinereus에서 이와 유사한 유전자를 분리하였다. RADS 유사 유전자를 분리하기 위하여 균류 C. cinereus의 염색체 DNA를 전기영동하여 분리한 다음 효모 RADS DNA를 probe로 하여 이와 hybridization하였다. 이 결과 RADS유사 유전자는 3.4kb의 insert DNA를 갖고 있었다. 또한 Southern hybridization으로 이 유사 유전자는 fungus C. cinereus의 염색체에 존재함을 확인하였다. 분리한 RADS 유사 유전자의 전사체 크기는 2.8kb 였으며, 자외선의 상해시 전혀 자외선에 대한 유도성이 없음을 Northern hybridization으로 확인하였다. 또한 유사유전자 부분을 삭제하였을 때 이 부분이 없는 세포는 전혀 생존을 못하였다. 이 결과 분리한 RADS 유사유전자는 세포의 생존에 필수적인 유전자임을 알 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제20권9호
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• pp.1306-1313
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• 2010

한우의 반추위에서 게놈 DNA를 분리하여 메타게놈 은행을 구축한 다음 carboxylesterase를 암호화하는 유전자를 클로닝 및 유전자를 선별하였다. 선별된 유전자의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하고 유전산물의 생화학적인 특성을 조사하였다. est1R 유전자는 2,465 bp로 366개의 아미노산 잔기를 가진 단백질을 암호화하였으며 이 단백질의 이론적인 분자량은 61,166 Da이었다. Est1R단백질은 PNB carboxylesterase (P37967), acetylcholinesterase (1EEAA) 및 chain A (1H23A)와 각각 5.9%, 6.1%, 6.1% 상동성을 가지고 있었다. 이러한 검색 결과 기존의 알려진 lipase 및esterase와의 상동성이 낮은 것으로 보아 새로운 그룹의 효소로 추정된다. Est1R효소의 최적 pH는 7.0 근방이었으며 최적 온도는 $40^{\circ}C$ 부근이었다. 한편 10% 유기용매를 함유한 기질의 효소활성측정에서 대조구에 비해 methanol은 95%의 상대적인 활성을 가진 반면에 hexane 용액에서는 그 활성이 반으로 감소하였다. 따라서 유기용매 농도의 작용성에 따라 이 효소의 산업적 이용성도 가능하리라 추정된다.

• 한국균학회지
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• 제28권1호
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• pp.22-25
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• 2000

Cosmid clone으로부터 mating activity를 가지는 pSC13의 양 말단은 1-71 $A{\alpha}3$ 교배유전자좌 Z3부위 2,430 bp와 Y3 region 8,160 bp 부근에서 homology를 지니는 것으로 나타나 교배활성에 필요한 모든 부위를 함유하는 것으로 사료되었다. 그리고 pSCE2는 1-71 $A{\alpha}3$의 Y region의 6,080 bp 부근에서 거의 완전한 homology를 가지는 것으로 보아 $A{\alpha}3$의 Y region을 함유하고 있음을 알 수 있으며, 또한 pSCE1도 MEP의 일부 sequence와도 거의 완전한 homology를 가지는 것으로 나타나 1-71 $A{\alpha}3$ 교배유전자좌와 모두 유사한 염기서열를 모두 지니면서 북미자생 치마버섯의 교배유전자좌의 염기배열이 남미자생의 것과 거의 유사한 분자적 구조를 지니고 있음을 나타내었다. 결정된 DNA sequence는 3265 bp로서 남미산 치마버섯 1-71 stain의 mating활성을 나타내는 $A{\alpha}3$ locus 염기서열중에 Z region과 거의 완전한 약 96%의 homology를 나타내었다. 또한 Polypeptide sequence비교에서도 약 82%의 높은 homology를 나타내었으며, 특히 transcription regulator로 알려진 homeodomain 및 acidic region에서는 각각 약 74%. 82%의 상당히 높은 비율의 homology를 지니고 있음이 확인되었다. 이러한 결과로 보아 남미와 북미의 대륙간에 자생하는 같은 allele type간에도 상당히 높은 비율의 교배유전자좌의 보존이 이루어지고 있음을 알 수 있다.

• 생명과학회지
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• 제12권2호
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• pp.173-181
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• 2002

북미산 S. commune UVMl-34의 A $\alpha$ 3 mating locus를 지니는 cosmid clone pSC13의 mating activity에 필요한 sequence 함유여부를 확인한 후 sequencing을 행하고 이에 대한 비교분석을 실시하였다. 그 결과 blast program을 사용한 전체 nucleotide 염기서열의 homology비교분석에서 남미산 1-71에 패하여 약 96%의 높은 homology를 나타내었으며, 1-71 A $\alpha$ 3 mating locus에서 모두 7개로 추정되는 exon의 염기서열의 비교실험에서도 거의 96% 이상에 이르는 homology를 나타내었다. 부분적으로는 AR (acidic rich region)에서 약 97%, HD (homeodomain)에서는 약 99%, BR (basic rich region)에서 약 97%, 그리고 Ser (serine rich regon)에서 약 95%의 높은 homology를 나타내어 지역간에 유전자상의 큰 변화는 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 그리고 translated polypeptide sequence 를 이용하여 자생지가 다른 남미산 S. commune A $\alpha$ 3 mating locus 내의 Y-region은 비롯하여 다른 $A\alpha$ alleles내의 Y-region과 비교 분석한 결과 남미산에 대해 전체적으로 약 97%의 높은 homology를 나타내고 있지만 그 외 $A\alpha$ mating alllele gene의 Y-region과는 41~49%의 낮은 homology로 mating activity에 관여하고 있는 것으로 나타났다. 특히 mating에 있어 transcription regulator로 알려진 homeodomain에서는 약 98%의 homology가 나타남으로서 Z-region의 74%에 비하여 대륙간에 상당히 높은 유전자 보존상이 확인되었다. 또한 AR에서 97%, BR에서 100% 그리고 Ser에서도 98%의 상당히 높은 homology를 지니는 사실을 확인하였다. 이러한 결과로 보아 남미와 북미에 자생하는 같은 mating allele type간에는 상당히 높은 비율의 염기서열 보존이 이루어지고 있음을 알 수 있었으며, 비록 다른 $A\alpha$ alleles간의 비교 이지만 다른 mating alleles간의 약 50% homology와 비교할 때 보다 상당히 높은 결과로 보인다. 특히 homeodomain motif의 비교에서 Y1을 비롯한 다른 mating allele gene과도 85% 이상의 높은 homology를 나타내었으며 그 외 AR, BR, Ser 부위에서는 10~50%에 이르는 낮은 비율로 나타났다.

• Journal of Microbiology
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• 제44권2호
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• pp.192-199
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• 2006

Pseudomonas putida KL47 is a natural isolate that assimilates benzene, 1-alkylbenzene $(C_1-C_4)$, biphenyl, p-cumate, and p-cymene. The genetic background of strain KL47 underlying the broad range of growth substrates was examined. It was found that the cym and cmt operons are constitutively expressed due to a lack of the cymR gene, and the tod operon is still inducible by toluene and biphenyl. The entire array of gene clusters responsible for the catabolism of toluene and p-cymene/p-cumate has been cloned in a cosmid vector, pLAFR3, and were named pEK6 and pEK27, respectively. The two inserts overlap one another and the nucleotide sequence (42,505 bp) comprising the cym, cmt, and tod operons and its flanking genes in KL47 are almost identical (>99 %) to those of P. putida F1. In the cloned DNA fragment, two genes with unknown functions, labeled cymZ and cmtR, were newly identified and show high sequence homology to dienelactone hydrolase and CymR proteins, respectively. The cmtR gene was identified in the place of the cmtI gene of previous annotation. Western blot analysis showed that, in strains F1 and KL47, the todT gene is not expressed during growth on Luria Bertani medium. In minimal basal salt medium, expression of the todT gene is inducible by toluene, but not by biphenyl in strain F1; however, it is constantly expressed in strain KL47, indicating that high levels of expression of the todST genes with one amino acid substitution in TodS might provide strain KL47 with a means of adaptation of the tod catabolic operon to various aromatic hydrocarbons.

• 생명과학회지
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• 제18권11호
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• pp.1592-1599
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• 2008

$\beta$-Lactam계 항생물질에 강한 내성을 가지는 균주 Bacillus sp. J105가 생산하는 $\beta$-lactamase의 유전자를 E. coli DH5$\alpha$에 cloning하였다. Cosmid vector pLAFR3을 이용하여, Sau3AI 으로 부분 분해한 chromosomal DNA와 BamHI으로 처리한 pLAFR3을 ligation하였다. In vitro packaging kit를 사용하여 E. coli에 형질도입 하였으며 $\beta$-lactamase양성 clone주를 획득하였다. 이 recombinant plasmid ($\beta$-lac+)를 pACYC184 (4.2kb) vector를 사용하여 subcloning 하여 최종 $\beta$-lactamase의 활성이 있는 6.4 kb 단편이 포함된 pKL11${\Delta}4.6$을 제작하였다. 이 단편을 DNA 염기서열을 분석한 결과 309개의 아미노산으로 구성된 $\beta$-lactamase를 코딩하는 927 bp를 포함하고 있었다. 클로닝된 $\beta$-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 170 bp의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 $\beta$-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다. 본 연구에서 클로닝된 $\beta$-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cereus의 $\beta$-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 $\beta$-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus 와 유전학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주었다. 이 pKL11-${\Delta}4.6$를 E. coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 $\beta$-lactamase의 secretion efficiency는 약 $4{\sim}5%$％였다. E. coli의 세포 내 단백질로부터 $\beta$-lactamase를 정제하여 분자량을 확인한 결과 31 kDa로 wild type의 분자량과 일치함을 확인하였다.