• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제29권1호
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• pp.126-133
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• 2016

A gene from Actinomyces sp. Korean native goat (KNG) 40 that encodes an endo-${\beta}$-1,4-glucanase, EG1, was cloned and expressed in Escherichia coli (E. coli) $DH5{\alpha}$. Recombinant plasmid DNA from a positive clone with a 3.2 kb insert hydrolyzing carboxyl methyl-cellulose (CMC) was designated as pDS3. The entire nucleotide sequence was determined, and an open-reading frame (ORF) was deduced. The ORF encodes a polypeptide of 684 amino acids. The recombinant EG1 produced in E. coli $DH5{\alpha}$ harboring pDS3 was purified in one step using affinity chromatography on crystalline cellulose and characterized. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis/zymogram analysis of the purified enzyme revealed two protein bands of 57.1 and 54.1 kDa. The amino terminal sequences of these two bands matched those of the deduced ones, starting from residue 166 and 208, respectively. Putative signal sequences, a Shine.Dalgarno-type ribosomal binding site, and promoter sequences related to the consensus sequences were deduced. EG1 has a typical tripartite structure of cellulase, a catalytic domain, a serine-rich linker region, and a cellulose-binding domain. The optimal temperature for the activity of the purified enzyme was $55^{\circ}C$, but it retained over 90% of maximum activity in a broad temperature range ($40^{\circ}C$ to $60^{\circ}C$). The optimal pH for the enzyme activity was 6.0. Kinetic parameters, $K_m$ and $V_{max}$ of rEG1 were 0.39% CMC and 143 U/mg, respectively.

• 한국균학회지
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• 제36권2호
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• pp.189-195
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• 2008

Aspergillus nidulans는 빛이 없는 조건에서는 유성분화가 주로 일어나고 빛이 있는 조건에서는 유성분화가 억제되고 대신 무성분화가 유도된다. 빛에 의해서 유성분화가 억제되는 것은 빛에 반응하여 유성 또는 무성분화를 조절하는 유전자가 있다는 것을 시사한다. 따라서 빛에 의해서 조절되는 유전자를 연구하기 위하여 광 조건하에서 유성분화를 하는 silA98 돌연변이를 분리하였으며, 이를 보완하는 유전자를 분리 및 분석하고자 A. nidulans의 AMA-NotI genomic library로부터 silA98 돌연변이를 상보하는 유전자 silA를 분리하였다. silA 유전자의 예상 ORF는 2,388 bp의 염기로 구성되어지고 795개의 아미노산을 암호화하고 있었다. 이 유전자는 Saccharomyces cerevisiae의 ARO80 유전자와 상동성을 보이며 SilA 단백질의 N 말단에는 약 51.9%의 상동성을 가지는 ${Zn_2}{Cys_6}$ motif를 지니고 있었다. silA 유전자 결손돌연변이주는 광 존재 하에서뿐만 아니라 고농도의 sorbitol에서도 유성분화가 유도되었다. 이는 silA 유전자가 빛과 고삼투 조건에서 유성분화를 억제하는 조절과정에 관여하고 있음을 의미한다. silA 유전자를 niiA promoter로 과다 발현시켰을 때의 형질은 야생형과 큰 차이를 보이지 않았다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권6호
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• pp.1115-1123
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• 2016

_L-Asparaginase (E.C. 3.5.1.1) is an enzyme involved in asparagine hydrolysis and has the potential to effect leukemic cells and various other cancer cells. We identified the _L-asparaginase gene (_L-ASPG86) in the genus Mesoflavibacter, which consists of a 1,035 bp open reading frame encoding 344 amino acids. Following phylogenetic analysis, the deduced amino acid sequence of _L-ASPG86 (_L-ASPG86) was grouped as a type I asparaginase with respective homologs in Escherichia coli and Yersinia pseudotuberculosis. The _L-ASPG86 gene was cloned into the pET-16b vector to express the respective protein in E. coli BL21 (DE3) cells. Recombinant _L-asparaginase (r-_L-ASPG86) showed optimum conditions at 37-40℃, pH 9. Moreover, r-_L-ASPG86 did not exhibit glutaminase activity. In the metal ions test, its enzymatic activity was highly improved upon addition of 5 mM manganese (3.97-fold) and magnesium (3.35-fold) compared with the untreated control. The specific activity of r-_L-ASPG86 was 687.1 units/mg under optimum conditions (37℃, pH 9, and 5 mM MnSO₄).

• 생명과학회지
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• 제31권7호
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• pp.671-676
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• 2021

쌍별 귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)에서 lethal (2) essential for life [l(2)efl]을 코드한 cDNA를 분리하여 GBl(2)efl이라 하였다. GBl(2)efl는 N-glycosylation 한곳과 phosphorylation site를 15곳 가진 189 aa로 구성되며6.2등전점과 21.19 kDa 분자량을 가진다. GBl(2)efl 단백질의 이차구조는 random coils (56.08%), alpha-helix (22.22%), extended strands (17.99%), beta turns (3.7%)로 이루어진다. GBl(2)efl 는 지금까지 보고된 l(2)efl들과는48-69%의 상동성을 보인다. GBl(2)efl은1일, 3일 starvation일때에 각각 dorsal longitudinal flight muscle과 Malpighian tubules에서 mRNA발현이 증가하였다. 한편, ER stress 조건에서는GBl(2)efl 발현은 fat body에서 증가하였다. 본 연구는 곤충의 생존에 기여하는 생리학적 메커니즘을 이해와 효과적인 해충 관리 통제를 수행할 수 있는 능력을 향상에 많은 힌트를 줄 수 있는 실마리를 제공할 수 있을 것이다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제23권3호
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• pp.292-301
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• 2010

Follicle-stimulating hormone (FSH) is a pituitary glycoprotein hormone that is encoded by separate alpha- and betasubunit genes. It plays a key role in stimulating and regulating ovarian follicular development and egg production in chicken. FSH signal transduction is mediated by the FSH receptor (FSHR) that exclusively interacts with the beta-subunit of FSH, but characterization of prokaryotic expression of the FSHb gene and its effect on the expression of the FSHR gene in local chickens have received very little attention. In the current study, the cDNA fragment of the FSHb gene from Dagu chicken was amplified using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and inserted into the pET-28a (+) vector to construct the pET-28a-FSHb plasmid. After expression of the plasmid in E. coli BL21 (DE3) under inducing conditions, the recombination protein, $FSH{\beta}$ subunit, was purified and injected into the experimental hens and the effect on the mRNA expression levels of the FSHR gene was investigated. Sequence comparison showed that the coding region of the FSHb gene in the local chicken shared 99%-100% homology to published nucleotides in chickens; only one synonymous nucleotide substitution was detected in the region. The encoded amino acids were completely identical with the reported sequence, which confirmed that the sequences of the chicken FSHb gene and the peptides of the $FSH{\beta}$ subunit are highly conserved. This may be due to the critical role of the normal function of the FSHb gene in hormonal specificity and regulation of reproduction. The results of gene expression revealed that a recombinant protein with a molecular weight of about 19 kDa was efficiently expressed and it was identified by Western blotting analysis. After administration of the purified $FSH{\beta}$ protein, significantly higher expression levels were demonstrated in uterus, ovary and oviduct samples (p<0.05). These observations suggested that the expressed $FSH{\beta}$ protein possesses biological activity, and has a potential role in regulation of reproductive physiology in chickens.

• 원예과학기술지
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• 제30권2호
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• pp.162-170
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• 2012

스프레이 국화품종 'Argus'와 감마선 조사에 의해 화색변이가 일어난 돌연변이체의 꽃잎으로부터 안토시아닌 생합성 경로에서 중요한 역할을 담당하는 신규 $DgF3'H$의 전장 cDNA와 genomic DNA를 분리하였다. 전장 cDNA는 1,527bp(509 아미노산)의 ORF를 포함하고 있으며, 원품종 'Argus'와 화색변이체 사이의 염기서열 상동성은 97% 이상을 나타내었다. Genomic DNA의 크기는 야생형 'Argus'에서 3,831bp이었고, 3가지 화색 변이체에서는 3,828부터 3,838bp의 크기를 나타내었다. $DgF3'H$ 유전자는 세 개의 exon사이에 두개의 intron을 갖고 있는 구조이고, 3'과 5' UTR 부분을 제외한 intron의 크기는 야생형 'Argus'에서 2,157bp이지만 3가지 화색 변이체에서는 2,155부터 2,159bp의 크기를 갖고 있었다. 이것은 감마선 조사에 의해 intron 부분의 유전자가 결실 또는 삽입된 것으로 추정된다. Southern 분석 결과 국화의 genome 내에서는 복수의 F3'H 유전자를 갖는 것이 확인되었다. $DgF3'H$ 유전자의 발현 정도를 분석한 결과, 연분홍의 'Argus'와 두 개의 보라색 변이체(AM1 and AM3)에서 높게 발현되었으나 흰색 변이체(AM2)에서는 매우 약하게 발현되었으며, 염기서열 변이에 의한 F3'H 유전자의 구조적 차이가 화색의 변이에 관련된 것으로 추정되었다. 국화 'Argus' 및 화색 변이체를 이용하여 본 연구에서 분리한 신규 F3'H 유전자의 구조 및 유전자 발현 등을 포함하는 유전정보들은 화색 변이의 유전적 기작을 밝히는데 중요한 자료로 이용될 것으로 기대되나 향후 다른 유전적 발현요소들이 국화의 F3'H 유전자의 발현에 관여하는지에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 하겠다.

• BMB Reports
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• 제39권5호
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• pp.502-510
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• 2006

2C-methyl-D-erythritol 2, 4-cyclodiphosphate synthase (MECPS, EC: 4.6.1.12) is the fifth enzyme of the non-mevalonate terpenoid pathway for isopentenyl diphosphate biosynthesis and is involved in the methylerythritol phosphate (MEP) pathway for ginkgolide biosynthesis. The full-length mecps cDNA sequence (designated as Gbmecps) was cloned and characterized for the first time from gymnosperm plant species, Ginkgo biloba, using RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique. The full-length cDNA of Gbmecps was 874 bp containing a 720 bp open reading frame (ORF) encoding a peptide of 239 amino acids with a calculated molecular mass of 26.03 kDa and an isoelectric point of 8.83. Comparative and bioinformatic analyses revealed that GbMECPS showed extensive homology with MECPSs from other species and contained conserved residues owned by the MECPS protein family. Phylogenetic analysis indicated that GbMECPS was more ancient than other plant MECPSs. Tissue expression pattern analysis indicated that GbMECPS expressed the highest in roots, followed by in leaves, and the lowest in seeds. The color complementation assay indicated that GbMECPS could accelerate the accumulation of $\beta$-carotene. The cloning, characterization and functional analysis of GbMECPS will be helpful to understand more about the role of MECPS involved in the ginkgolides biosynthesis at the molecular level.

• 원예과학기술지
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• 제28권4호
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• pp.648-655
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• 2010

본 연구에서는 들잔디와 돌연변이체에서 Glyphosate 내성 관련 유전자인 EPSPS를 코딩하는 cDNA를 분리하여, 시퀸스 비교분석과 발현 양상 차이 등에 관하여 조사하였다. 5'/3' RACE를 통하여 밝혀진 EPSPS의 cDNA는 각각 1176bp의 open reading frame으로 이루어져 있으며 391개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 이는 보고된 다른 EPSPS 유전자들과 높은 유사성을 가지고 있다. Genomic southern 결과 들잔디 내에 EPSPS 유전자는 단일copy로 존재하였다. Wild type과 제초제 내성 변이체의 EPSPS 유전자는 6개의 아미노산 시퀀스의 차이를 보였으며 기존에 보고된 EPSPS active site에서 시퀀스의 차이를 나타냈다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 EPSPS 효소활성 저해 작용을 알아본 결과, 내성 개체에서 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. Northern 분석과 RT-PCR로 제초제 처리 시간에 따른 EPSPS의 발현량을 살펴본 결과, 제초제 처리 후 시간이 경과할수록 발현량이 증가하다가 7일 이후에는 감소하였고, wild type에 비해 glyphosate 내성 선발개체에서 전체적인 발현량이 높음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 선발된 glyphosate 내성 돌연변이체는 높은 EPSPS 효소활성 증가 및 EPSPS active site의 아미노산 시퀀스 변화를 통해 원할하고 지속적인 방향족 아미노산의 합성이 가능한 것으로 보여졌다. 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 내성 잔디 돌연변이체와 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제27권11호
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• pp.1276-1289
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• 2017

참담치 hemocyte에 존재하는 항균 펩타이드를 역상 HPLC column을 사용하여 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrophotometer (MALDI-TOF/MS) 분석을 통해 분자량이 3330.549 Da이며, edman 분해법을 통해 14개의 N-말단 아미노산 서열을 확보하였다. 분석한 N-말단 서열은 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1과 protamine-like PL-III protein과 각각 93%와 87%의 유사도를 나타냈으며, M. edulis의 sperm-specific protein Phi-1과 87% 일치함을 확인하였다. 또한 open-reading frame (ORF)은 306 bp의 길이에 101개의 아미노산을 코딩하고 있음을 밝혔으며, 이는 M. californianus의 sperm-specific protein Phi-1와 93.5% 유사하였다. 분자량과 아미노산 서열에 근거하여 31개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 합성하였으며 이는 그람 양성균인 B. subtilis, S. mutans, S. aureus와 그람 음성균인 E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa 그리고 진균류인 C. albicans에 항균 활성을 보였다. 합성한 펩타이드는 항생제 내성균주인 S. aureus CCARM 0203와 S. aureus CCARM 0204에 항균 활성을 보였다. 합성 항균 펩타이드는 넙치 혈장에 대한 용혈현상은 없었고, 세포독성을 확인한 결과 HUVEC cell line에 전혀 독성을 보이지 않았다. 본 연구결과, 참담치의 혈구로부터 분리 및 정제한 sperm-specific protein 유래 항균 펩타이드는 다양한 균주에 항균 활성을 보였고 낮은 세포독성을 가졌으며, 이러한 특성은 본 실험에서 분리한 항균 펩타이드가 항생제 대체재로서 개발 가능성을 제시하고 있다.

• 생명과학회지
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• 제26권4호
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• pp.419-430
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• 2016

멜론 흰가루병(Podosphaera xanthii)은 멜론 생산량에 영향을 미치는 중요한 병해 중 하나로 알려져 있다. 작물 육종에 있어서 흰가루병을 포함한 병저항성 계통 육성은 병저항성 관련 유전자들의 유전양식 및 그 유전자들을 조절하는 식물호르몬에 대한 정보는 매우 중요하다. 식물에 있어 흰가루병균 저항성에 관여한다고 알려진 Mildew Resistance Locus O (MLO) 유전자를 멜론 database인 ‘Melonomics’으로부터 14개 동정하여 CmMLO1~14 (ucumis elo MLO)로 표기하였다. 동정된 14개의 CmMLO유전자들의 아미노산 서열을 비교한 결과, 9개의 CmMLO 유전자들은 흰가루병균에 대한 감수성 관련 아미노산 cysteine과 proline이 잘 보존되어 있었지만, 나머지 CmMLO 유전자들은 다른 아미노산 서열을 가지고 있었다. 멜론 흰가루병의 7 race에 대하여 이병성을 나타내는 멜론 계통 ‘SCNU1154’에 멜론 흰가루병균(P. xanthii)을 접종하고, 식물호르몬(metyl jasmonate와 salicylic acid) 처리한 후 qPCR을 통해 CmMLO 유전자들의 상대적인 발현양을 분석한 결과, 멜론 흰가루병 7 race에 대하여 14개의 CmMLO 유전자들 중 3개의 유전자들에서 발현이 증가하였고, 7개의 유전자들은 발현이 감소하였으며, 4개의 CmMLO 유전자들은 race 특이적으로 발현양이 증가 혹은 감소하였다. 또한 14개의 CmMLO 유전자들의 발현양은 methyl jasmonate와 salicylic acid를 처리하였을 때 다양한 발현 양상을 나타내었다. 11개의 CmMLO 유전자들은 salicylic acid 처리하였을 때 발현양이 증가하였으며, 7개의 유전자들은 methyl jasmonate 처리하였을 때 발현양이 증가하였다. 이와 같이, 스트레스에 반응을 보이는 CmMLO 유전자들은 멜론 흰가루병 저항성 계통 육성을 위한 유용한 정보가 될 것으로 기대된다. C m