• 생명과학회지
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• 제19권11호
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• pp.1522-1528
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• 2009

알긴산을 분해하기 위하여 갈조류로부터 분해활성이 있는 해양미생물을 분리하였다. 분리된 균주의 16S ribosomal DNA를 분석한 결과 이전에 보고했던 ALG-5 균주와 비슷한 Streptomyces sp.에 속하는 것으로 나타났다. 상동성이 있는 염기서열로 고안한 특이적인 primer로 PCR을 행함로서 Streptomyces sp. M3의 새로운 alginate lyase 유전자를 클로닝하였다. M3 alginate lyase의 예상 아미노산 서열에는 N-terminal 영역에 YXRSELREM 서열과 C-terimnal 영역에 YFKAGXYXQ 서열이 보존되어 있었다. M3 alginate lyase 단백질의 homology model은 Corynebacterium sp. ALY-1으로부터 얻은 단백질인 alyPG와 같이 $\beta$-jelly roll fold를 main domain으로 가지고 있음이 나타났다. M3 alginate lyase 유전자를 가지는 재조합 E. coli의 세포균질액은 polymannuronate block보다는 polyguluronate block에 대하여 높은 분해력을 가지고 있었다. 아미노산 서열 다중정열 및 homology modeling으로부터 얻은 결과는 M3 alginate lyase가 Family PL-7으로 분류될 수 있음을 말해 준다.

• KSBB Journal
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• 제26권6호
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• pp.538-542
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• 2011

The research was purposed production of oligosaccharide from alginate hydrolysis the main composition in cell walls of sea weed. We was isolated 252 strains from sea water and mud flat, the highest alginate lyase activity was selected, and identified as Sanguibacter keddieii NC9 by 16S rDNA sequence analysis. In this study was select the sodium alginate concentration, pH, temperature for the production of alginate lyase activity. Alginate lyase activity was confirmed from plate assay with 10% cetylpyridinium chloride. The optimum culture conditions for the production of alginate lyase were sodium alginate 10 g/L, peptone 5 g/L, $40^{\circ}C$, pH 9 and 36 hours incubation time. Sanguibacter keddieii NC9, its alginate lyase would be useful for the production of bioenergy and biofunctional oligosaccharides from sea weed.

• 생명과학회지
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• 제20권11호
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• pp.1582-1588
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• 2010

전 연구에서 해양세균 Streptomyces sp. M3의 새로운 alginate 분해효소를 signal peptide가 제거된 상태로 클로닝하고 E. coli BL21 (DE3) 균에 형질전환시켰다. 본 연구에서는 배양할 때 IPTG를 첨가하여 M3 alginate 분해효소 단백질을 과발현시키고 Ni-Sepharose 친화력 chromatography로 정제하여 생화학적 성질을 조사하였다. 기질특이성을 시험하기 위한 235 nm에서의 흡광도와 TLC 분석 결과로부터 M3 alginate 분해효소가 polyG block에 기질특이성을 나타냄을 알 수 있었다. M3 분해효소를 기질과 10분 동안 반응시켰을 때, 최적 pH 및 최적온도는 pH 9 및 $60^{\circ}C$이었다. 1 mM $Ca^{++}$ 및 $Mn^{++}$은 alginate 분해활성을 2배 증가시킨 반면 $Hg^{++}$ 및 $Zn^{++}$는 분해활성을 완전히 저해하였다. $Mg^{++}$, $Co^{++}$, $Na^+$, $K^+$, 및 $Ba^{++}$은 M3 alginate 분해효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않았다.

• 생명과학회지
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• 제17권1호
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• pp.132-136
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• 2007

E. coli에서 Pseudoalteromonas elyakovii 유래의 alginate lyase유전자(aly)를 발현시킬 때, 대부분의 단백질이 불용성 내포체 형태로 발현됨을 확인하였다. Alginate lyase를 가용성 활성형으로 생산하기 위해 aly와 DnaK/DnaJ/GrpE 또는 aly와 GroEL/ES을 공발현하는 형질전환체를 얻었다. 공발현 결과, 단백질의 올바른 접힘을 도와주는 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone이 가용성 및 활성형의 alginate lyase 생산에 매우 효과적임을 알 수 있었다. DnaK/DnaJ/GrpE chaperone의 발현에 유도제인 L-arabinose 최적 농도는 0.05 mg/ml이었으며, 이러한 공발현에 의해 약 34%의 alginate lyase가 가용성 분획에서 생산되었다. 또한 10%의 cetylpyridinium chloride를 첨가함으로써, 공발현 콜로니 주위에 투명환이 형성됨을 확인할 수 있었고, 이는 활성형 alginate lyase 효소에 의해 alginate가 분해되었음을 시사하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제29권2호
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• pp.72-77
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• 2001

Strong promoter로 밝혀진 alginate lyase 유전자의 promoter 부위에 대한 특성을 검토하기 위해 alginate lyase 유전자의 46개 N-terminal amino acid가 포함된 promoter 부분과, 같은 균으로부터 분리한 $\beta$-agarase의 유전자를 연결시켜 agarase의 activity를 평판배지상에서 보다 쉽게 확인하는 방법으로 promoter의 활성을 측정한 결과 alginate lyase 유전자 promoter에 의해서 $\beta$-agarase 유전자의 대량발현이 유도되고 있었으며 glucose의 존재하에서 $\beta$-agarase 유전자 발현이 일어나지 않는 catabolite repression 양상을 나타내고 있다. PCR로써 alginate lyase의 46개 N-terminal amino acid 부분이 순차적으로 제거된 plasmid를 제조하여 대량발현을 조사한 결과 46개의 아미노산이 제거된 후에도 $\beta$-agarase의 활성에는 변화가 없어 46개의 N-말단이 정상적인 상태에서 발현에는 영향을 미치고 있지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 alginate lyase 유전자의 promoter region에 존재하는 가능한 2개의 promoter consensus sequence PI, PII를 subcloning한 결과 promoter PII만이 존재할 때도 대량발현이 유도되고 있음을 확인할 수 있었으며 동시에 glucose가 존재할 때 catabolite repression이 역시 나타나고 있어 이 부분이 발현 및 glucose에 의한 regulation에 매우 중요하게 작용하는 부분이라는 것을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제25권2호
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• pp.130-135
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• 2015

Pseudoalteromonas elyakovii 유래 alginate lyase 유전자(aly)를 대장균에서 발현시켰을 때, 발현된 대부분의 유전자 산물은 내포체라는 불용성 응집체 형태로 생산되었다. Alginate lyase를 가용성 및 활성형으로 생산하기 위해 Aeropyrum pernix K1 유래의 초고온성 샤페로닌 ApCpnA와 ApCpnB를 공발현 파트너로 도입하였다. aly와 ApCpnA와 ApCpnB 각각과의 공발현 결과, aly 단독발현 때의 alginate lyase 활성 10.1 unit/g-soluble protein에서 ApCpnA와의 공발현 때는 83.1 unit/g-soluble protein, ApCpnB와의 공발현 때는 100.3 unit/g-soluble protein으로 가용성 및 활성형으로의 alginate lyase 생산이 8~10배 크게 향상되었다. 다양한 배양 조건들의 조사를 통해 alginate lyase 최대 생산을 위한 조건은 다음과 같았다: 1.0 mM IPTG, $25^{\circ}C$ 배양 온도(IPTG 유도 후), ApCpnB 공발현 파트너. 이러한 공발현 시스템은 대장균에서 기능적으로 또한 의학적으로 중요한 재조합 단백질의 산업적 생산에 크게 유용하게 사용될 것이다.

• 통합자연과학논문집
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• 제3권2호
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• pp.72-77
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• 2010

Alginate lyases, also known as alginases or alginate depolymerases, catalyze the degradation of alginate by a ${\beta}$-elimination mechanism that has yet to be fully elucidated. Alginate is a copolymer of ${\alpha}$-L-guluronate (G) and its C5 epimer ${\beta}$-D-mannuronate (M), arranged as homopolymeric G blocks, M blocks, alternating GM or random heteropolymeric G/M stretches. Almost all alginate lyases depolymerize alginate in an endolytical fashion via a ${\beta}$-elimination reaction. The alginate lyase Atu3025 from Agrobacterium tumefaciens strain C58, consisting of 776 amino-acid residues, is a novel exotype alginate lyase classified into polysaccharide lyase family 15. Till now there is no crystal structure available for this class of proteins. Since there is no template with high sequence identity, three-dimensional coordinates for exotype alginate lyase (PL 15 family) were determined using modeling methods (Comparitive modeling and Fold recognition). The structures were modeled using the X-ray coordinates from Heparinase protein family (PDB code: 3E7J). This enzyme (Atu3025) displays enzymatic activity for both poly-M and poly-G alginate. Since poly-M is widespread; docking of a tri-mannuronate against the modeled structure was performed. We identified some of those residues which are crucial for lyase activity. The results from this study should guide future mutagenesis studies and also provides a starting point for further proceedings.

• 한국수산과학회지
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• 제29권5호
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• pp.637-642
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• 1996

해양으로부터 alginate lyase분해능이 있는 Pseudomonas sp.을 분리하여 이 균으로부터 alginate lyase 유전자를 E. coli에 cloning 하여 재조합 alginate lyase의 특성을 검토하였다. 재조합 alginate lyase는 E. coli에서 $50\%$ 이상이 expression되었다. 또한 생산된 재조합 alginate lyase는 세포외로의 분비가 없었으며, 전자현미경으로 확인한 결과 대부분이 inclusion body를 형성하지 않고 세포질내에서 soluble한 형태로 존재하고 있는 것으로 나타났다. 활성을 나타내는 최적 조건은 온도 $20^{\circ}C$, pH 7.0으로 보여주고 있으며 기질에 대한 Km값은 $0.4\%$, Vmax는 625 unit/mg이었다.

• 생명과학회지
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• 제24권2호
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• pp.128-136
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• 2014

알긴산은 ${\alpha}$-L-guluronic acid와 ${\beta}$-D-mannuronic acid가 (1-4) 결합한 선형 산성다당류이다. 알긴산은 다양한 알긴산 분해효소들에 의하여 분해되는데 ${\beta}$-제거반응으로 비환원 말단에 이중결합이 있는 불포화 우론산 올리고머가 생산된다. 본 연구실에서는 이전에 Stenotrophomonas maltophilia KJ-2로부터 새로운 구조를 가진 polyMG lyase를 재조합하였다. KJ-2 polyMG lyase의 단백질구조를 예측하기 위하여 상동성 모델링을 한 결과 Azotobacter vinelandii가 생산하는 세 종류의 polyMG lyase들이 모두 PL7 family에 속하는 반면 KJ-2 polyMG lyase는 PL6 family에 속하였다. 또한 $^1H$-NMR spectra를 분석한 결과 polyMG lyase는 M-${\beta}$(1-4)-G 당쇄결합을 분해하고 G-${\alpha}$(1-4)-M 결합은 거의 분해하지 못하는 것으로 나타났다. 예측된 polyMG lyase 모델을 기초로 하여 14군데 아미노산 잔기를 선택하였으며 17개의 돌연변이체를 만들어 알긴산 분해효소의 활성을 측정하였다. Lys220Ala, Arg241Ala, Arg241Lys및 Arg265Ala 돌연변이체들은 완전히 알긴산 분해효소의 활성을 잃었으며 Arg155Ala, Gly303Glu 및 Tyr304Phe 돌연변이체들의 분해활성은 19.1-39.3%까지 감소하였다. 이러한 결과들로부터 Arg155, Lys220, Arg241, Arg265, Gly303 및 Tyr304 들은 알긴산 분해효소의 촉매활성과 기질결합에 중요한 잔기들임을 알 수 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권5호
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• pp.681-686
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• 2015

The purpose of this study was to find a cold-adapted and surfactant-stable alginate lyase as a candidate for biotechnological and industrial applications. The gene for a new alginate lyase, AlyL1, from Agarivorans sp. L11 was cloned and expressed in Escherichia coli. The recombinant AlyL1 was most active at 40℃ (1,370 U/mg). It was a cold-adapted alginate lyase, which showed 54.5% and 72.1% of maximum activity at 15℃ and 20℃, respectively. AlyL1 was an alkaliphilic enzyme and most active at pH 8.6. In addition, it showed high stability in the presence of various surfactants at a high concentration (from 0.1% to 1% (w/v)). AlyL1 was an endo-type alginate lyase that degraded both polyM and polyG blocks, yielding disaccharides and trisaccharides as the main products. This is the first report of the cloning and functional expression of a cold-adapted and surfactant-stable alginate lyase. AlyL1 might be an interesting candidate for biotechnological and industrial applications.