곤충병원성 선충의 효율적 검색법 확립과 생물적 방제제로서 유용한 선충 종의 탐색을 위하여 수행된 연구로서 남한 각지의 다양한 생태환경에서 토양을 채집하고, 병원성 검정과 병행하여, 감염력과 증식력 및 보존력이 강한 계통을 선발하였으며, 각종 해충에 대한 살충력을 검정하여 생물적 방제제로서의 유용성을 시험하였다. 우리나라에서 검출된 곤충병원성 선충은 주로 Rhbditida에 속하는 Steinermatidae 및 1 Heterorhabditidae였으며, 본 연구에서도 Rhabditida의 선충이 다수를 차지하는 경향은 같았다. 그러나, Rhabditidae에서는 현재까지 알려진 Steinernematidae와 Heterorhabditidae외에도 19계통의 Rhabditidae와 2 계통의 Diplogasteridae가 새로 검출되었고, Tylenchida에 속하는 선충도 5계통이 발견되었으며, 금후 속 및 종 단위의 상세한 동정이 필요할 것이다. 병원성이 우수한 선충계통은 생존 유충과 번데기에서 개체당 20만∼30만 마리가 증식하였으므로, 증식용 숙주 1마리 분의 병원체로 구제가능한 해충의 이론치는 십만을 초월할 것으로 추산되었다. 선발 계통의 선충은 대부분 통성활물기생이며, 능동적인 숙주의 추적 및 감염치사한 사체에서 증식함은 "적극적 사물기생" 또는 "살생부생성"으로 간주할 수도 있었다. 본 연구는 생물살충제 연구를 위한 생태환경기술 개발에 필요한 자료를 제공할 뿐 아니라, 기초생명과학 연구용 선충 계통의 선발과 증식 및 보존 관리를 비롯하여 널리 활용될 수 있을 것이다.
1. 수원지방에서 다화성잠저승의 세대회수는 5~6회이다. 2. 다화성잠저승의 란, 유충, 용, 기간은 대체적으로 2일, 8일, 18일 간이다. 3. 기상조건 특히 온도에 대하여 본충의 세대기간은 큰 영향을 받는다. 각세대중에서 가장 짧은 세대는 제3세대로서 21일 14시간이고 가장 긴 세대는 제5세대로서 약40일 간이다. 4. 가잠에 기생한 본충의 유충은 탈출후 3.5cm-10.5cm 토중으로 들어가 화용한다. 5. 다화성잠저승은 용태월동을 하지 않고 유충태월동을 한다고 생각된다. 6. 실외사육에 있어서 본충에 대한 피해는 27.9% 였다. 7. 견잠에 있어서 다화성잠저승의 피해를 받을지라도 영견가능하고 견질에 대하여 큰 영향이 없다. 8. 수견후 본충의 전국 피해조사에 있어서 춘잠기가 6.36%, 추잠기가 4.09%, 년간 5.25%였다.
경란전염은 숙주의 생식소 감염이 전제되므로 Nosema bombycis 감염 집누에를 대상으로 생식소의 발육에 수반된 란 및 정자 형성과 경란전염의 성립에 미치는 영향을 해부 및 조직병리학적 측면에서 구명하였다. 생식소의 감염경로는 도관을 통하지않고 체공에 접한 주변부의 피막조직이 먼저 감염된후 난소내부로 병세가 확산되었고, 감염시기는 다른 조직에 비하여 지연되므로 중증인 개체에 한하여 생식소의 감염은 인정되었으나 란 및 정자 형성이 저해되고 숙주는 성충화 전에 치사하였다. 생식능을 보유한 경증의 감염개체에서는 난소의 감염이 번데기 초기까지 인정되지 않았으나 경란전달은 가능하였다. 병원포자는 자력으로 이동할 수 없으며 성숙란에 대한 침입 가능성도 부정적인 것으로 판단되었으므로, 경란전염이 성립되는 란의 감염시기는 난소소관이 체공에 직접 노출되는 번데기 시기의 2~3일경 부터 난소난의 난각형성이 개시되기 전인 제10 발육단계까지의 기간이 될 것으로 추정되었다.
누에의 사료에 대한 섭식성 반응이 다른 2계통에 대한 두부의 형태적 차이를 전자현미경적 관찰을 하였다 이들 2계통의 두부와 촉각의 형태적 차이는 변이가 심하고 다양하다. 섭식성 반응이 높은 계통에 있어서는 소시지의 돌기가 매우 잘 발달되어 있는 반면 섭식성 반응이 낮은 계통에 있어서는 형태적으로 퇴화되어 있다. 또한 촉각의 셋째마디의 유병돌기가 발달되어 있지 않으며 사료에 대한 섭식 반응이 낮고 극단적으로 퇴화되어 있는 개체는 사료를 감지하지 못하여 결국에는 굶어 죽은 것으로 사료된다.
잠 103$\times$잠 104 와 그 역교, 잠107$\times$잠108 및 그 역교를 공시하여 6개 업자의 잠종비중별 부화율 및 실용부화율 시험에서 얻은 결과는 1. 난비중을 세분하여 부화율 실용부화율을 보면 경비중에 비하여 중비중 및 중비중의 난이 부화율 및 실용부화율이 높았다. 2. 일모체는 중모체에 비하여 경비중 및 중비중난에서 부화률이 높았고 실용부화율은 경비중난에서만 높았다. 3. 중모체는 비중별 실용부화율 및 부화율의 차이가 컸으며 이에 비하여 일모체는 부화율에는 차이가 없으나 실용부화율에서 비중별 차이를 인정할 수 있었다. 4. 제조업자별 중비중난의 부화율 및 실용부화율의 차이는 없으나 경비중, 중비중난에서는 현저한 차이를 나타내었다.
Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR associated protein (Cas)9을 이용하는 유전자 가위 기술은 미래 육종 기술로서 주목받고 있다. 본 연구에서는 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 누에 kynurenine 3-monooxygenase (KMO) 유전자 편집을 통한 돌연변이 유발 및 선택 교배를 통하여 유전자의 세대간 전달을 분석하고자 하였다. 유전자 편집을 위하여 누에의 KMO 유전자에 대한 3종의 가이드 RNA를 제작하고, 제작된 gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성시켜 누에 세포주(BM-N)에 도입 후 T7 endonuclease I 분석을 수행하여 최적의 gRNA를 선발하였다. 선발된 K1N gRNA는 누에 유전자를 편집하기 위하여 Cas9 단백질과 복합체를 형성시킨 후 누에 초가 배아에 미세주사하고 사육하였다. 미세주사 후 부화율은 18% 가량으로 낮게 나타났으나 생존한 개체 중 돌연변이 발생율은 60% 이상으로 비교적 높게 나타났다. 돌연변이가 발생된 G0세대의 KMO 유전자는 이형접합자 형태로 나타났으며, 표현형의 변화는 관찰되지 않았다. 하지만 이형접합자들 사이의 근친 교배에 의해 탄생한 G1세대 돌연변이에서는 일부에서 알과 눈의 색 변화가 확인되었으며, 변이가 확인된 개체들사이의 근친교배를 통해 생산된 G2세대에서는 모든 개체에서 표현형의 변화가 나타났다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, 유전자 가위를 이용한 돌연변이 육종에는 한계가 있으나 전통 교배 육종과 융합을 통하여 육종 기간을 비약적으로 단축시킬 수 있는 곤충 육종 기술로 발전가능성이 높다고 판단된다.
13종의 식물 정유(anise oil, clove oil, marigold, mustard oil, neem oil, quassia, quilaja, rosemary oil, rotenone, tea tree extract, thyme oil, wintergreen oil, and yucca)와 caffeine이 산업곤충인 누에(Bombyx mori)와 생물적 방제 인자의 하나인 곤충병원성 선충 Steinernema carpocapsae GSN-1 계통(Sc)과 Heterorhabditis sp. Gyeongsan 계통(Hg)에 미치는 영향을 실내 검정하였다. 1,000 ppm 농도의 식물체 추출물들 중 neem oil이 누에에 대한 살충활성이 가장 높았다. Neem oil을 처리한 뽕잎을 공급하였을 때, 급상 5일과 10일 후 누에의 치사율은 각각 55.3%와 100%였다. 그리고 neem oil이 처리된 뽕잎을 섭식한 누에는 번데기와 고치를 형성하지 못하였다. Rotenone을 처리한 뽕잎을 공급받은 누에의 고치와 번데기 무게는 각각 0.27 g과 1.01 g으로 가장 적었다. Mustard oil은 곤충병원성선충에 대하여 살선충 활성이 높았다. X-plate에서는 mustard oil 20 ppm 처리 시 곤충병원성선충 Sc와 Hg의 치사율이 처리 3일 후 각각 69.0%와 100%였으며 5 ppm 농도에서도 4%와 36%의 치사율을 보였다. Sand barrier에서 Sc를 100 ppm 농도의 mustard oil과 혼합 처리 시 꿀벌부채명나방(Galleria mellonella) 노숙 유충의 치사율은 무처리구와 차이가 없었으나 Hg의 경우는 무처리구에 비하여 30% 낮은 꿀벌부채명나방 치사율을 보였다. 꿀벌부채명나방 유충의 체내에 정착한 선충 수는 Hg가 Sc에 비하여 적었다. Sand barrier내 생존 Sc 선충 수는 200 ppm 이하 농도에서는 무처리구와 차이가 없었다.
누에분말을 과일(키위, 파파야, 파인애플 및 배) 단백질 분해 효소로 반응시켜 생리활성작용 및 이화학적 특성을 조사하기 위하여 pH, 산도, 단백질 함량, 미네랄 함량, 지방산 조성, 단백질 패턴, 항산화 및 혈전용해 활성을 측정하였다. 누에분말은 각 과일 단백질 분해 효소로 $60^{\circ}C$에서 24시간 반응시켰다. 단백질 농도는 과즙액 처리 누에분말에서 약간 높은 것으로 나타났다. 누에분말의 주요 미네랄은 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 아연이였으며, 주요 지방산 조성은 linolenic acid, oleic acid 및 palmitic acid 였다. SDS-PAGE상의 단백질 패턴 분석에서 66-97 kDa 정도 크기의 누에 단백질 밴드가 파인애플, 파파야 및 배 반응에 의해서는 대부분 분해가 일어났지만, 키위 반응에 의해서는 거의 분해가 일어나지 않은 것으로 관찰되었다. 혈전용해 활성은 파파야 및 배 반응에 의한 누에분말에서만 나타났다. 항산화 활성은 0.1% 처리 농도에서 과일 단백질 분해 효소 반응에 의한 누에분말에서 미반응 누에분말 보다 증가하였으나, 시판 항산화제 BHT 처리보다는 활성이 많이 낮았다. 따라서 과즙액 처리 누에분말의 경우 반응 전 누에분말 보다 생리활성작용 및 이화학적 특성이 강화됨으로써 건강기능식품 소재로서의 가치가 증가된 것으로 사료되어 진다.
본 연구의 목적은 누에형질전환체를 이용하여 재조합단백질 대량생산 시스템을 개발하는 것으로서, 본 실험에서는 hSCF유전자를 이용하여 누에에서 재조합단백질을 생산하였다. 실험에 사용된 piggyBac 전이벡터는 hSCF 유전자의 발현 조절을 위해 초파리 유래의 dHsp70 promoter를 사용하였고, EGFP marker유전자는 3xP3 promoter로 발현을 조절하였다. 총 1,020 개의 누에알에 microinjection 하여 G1 세대에서 22 bloods의 형질전환체를 선발하였고, 선발된 누에형질전환체는 초기배 단계의 눈과 신경조직, 유충과 번데기 그리고 성충의 눈에서 GFP 형광을 관찰 할 수 있었다. hSCF 재조합단백질의 발현은 Western blot 분석으로 확인 할 수 있었고, inverse PCR 분석을 통해서 누에 게놈에 전이벡터가 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 지금까지의 실험 결과에서 hSCF 재조합 단백질이 누에에서 생산될 수 있음을 확인 할 수 있었다. 비록 누에에서 생산된 hSCF 재조합단백질의 생리활성에 대한 실험이 추후에 요구되지만, 이러한 실험결과는 piggyBac 전이벡터와 microinjection 법으로 누에에서 고부가가치의 재조합단백질을 대량생산 할 수 있음을 보여 주었다고 할 수 있겠다. 따라서 누에를 유용물질 생산을 위한 생체반응기로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
미성숙 흰쥐에서 누에 번데기 수용성과 지용성 추출 물 및 한약재가 첨가된 누에 번데기 수용성 추출물을 투여하여 에스트로젠 증식 관련 인자의 발현을 확인한 결과는 다음과 같다. 미성숙 흰쥐에서 누에 번데기 수용성 추출물(KW), 누에 번데기 지용성 추출물(KO) 및 KW에 하수오, 인삼, 울금을 7:1:1:1의 비율로 첨가한 복합체(MK)를 각각 100 mg/kg와 500 mg/kg의 농도로 30일간 경구투여한 결과 체중은 유의적인 변화를 나타내지 않았다. 체중에 대한 자궁의 무게는 정상 대조군에 대하여 실험군에서 KW500을 제외하고는 모두 유의적인 증가를 나타내었으며 K0500, KW100, MK100 순으로 각각 $0.49\%,\;0.48\%,\;0.44\%$의 높은 값을 나타내었다. 체중에 대한 난소의 무게는 정상 대조군에 대해 MK군을 제외하고 모두 유의적인 변화를 보였으며 KW100군이 가장 높은 값을 나타내었다. 미성숙 흰쥐의 혈청 내 AST와 ALT 활성 및 creatinine 농도는 모두 군 간에 유의적인 변화는 보이지 않았다. 즉 모든시료가 간과 신장에 독성을 나타내지 않은 결과이다. $ER\alpha$와 $ER\beta$의 발현을 densitometer로 수치화하여 정상대조군을 기준으로 발현의 증가와 억제를 백분율로 표시한 결과 KW100(100 mg/kg)와 MK500(500 mg/kg) 군이 $ER\alpha$의 발현을 유의적으로 증가시켰으며 KW100(100 mg/kg), KW500(500 mg/kg), 및 MK100(100 mg/kg)군이 $ER\beta$의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 따라서 누에 번데기 수용성 추출물 및 한약재(인삼, 하수오, 울금)를 첨가한 누에 번데기 수용성 추출물이 생체에서 높은 에스트로젠 활성을 가지고 있는 것으로 사료된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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