Zhang, Hui;Liu, Qi;Lin, Jia-Le;Wang, Yu;Zhang, Ruo-Xi;Hou, Jing-Bo;Yu, Bo
Biomolecules & Therapeutics
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제26권2호
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pp.121-129
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2018
Oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced macrophage foam cell formation and apoptosis play critical roles in the pathogenesis of atherosclerosis. Thioredoxin-1 (Trx) is an antioxidant that potently protects various cells from oxidative stress-induced cell death. However, the protective effect of Trx on ox-LDL-induced macrophage foam cell formation and apoptosis has not been studied. This study aims to investigate the effect of recombinant human Trx (rhTrx) on ox-LDL-stimulated RAW264.7 macrophages and elucidate the possible mechanisms. RhTrx significantly inhibited ox-LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in RAW264.7 macrophages. RhTrx also suppressed the ox-LDL-induced overproduction of lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1), Bax and activated caspase-3, but it increased the expression of Bcl-2. In addition, rhTrx markedly inhibited the ox-LDL-induced production of intracellular reactive oxygen species (ROS) and phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinases (MAPK). Furthermore, anisomycin (a p38 MAPK activator) abolished the protective effect of rhTrx on ox-LDL-stimulated RAW264.7 cells, and SB203580 (a p38 MAPK inhibitor) exerted a similar effect as rhTrx. Collectively, these findings indicate that rhTrx suppresses ox-LDL-stimulated foam cell formation and macrophage apoptosis by inhibiting ROS generation, p38 MAPK activation and LOX-1 expression. Therefore, we propose that rhTrx has therapeutic potential in the prevention and treatment of atherosclerosis.
Bacillus stearothermophilus exo-xylanase 유전자 DNA가 삽입된 재조합 plasmid pMG1을 가지고 있는 E.coli JM109 exo-xylanase 생산 최적 배양 조건, 생산 효소의 정제 및 정제 효소의 특성 등을 조사 연구하였다. 상기 재조합 E.coli 균주는 0.5 fructose, 0.5 yeast extract, 1.0 tryptone 및 1.0 sodium chloride가 함유된 배지에서 약 10시간 배양했을 때 최대량의 효소를 생산하였으며 생산효소의 94는 세포내에 존재하는 것으로 분석되었다. 생산 효소는 ammonium sulfate 분획, ion exchange chromatography 및 gel filtration 등의 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제하였으며 정제 효소는 pH 6.0과 $45^{\circ}C$에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었다.또한 1mM $Ca^{2+}$과 $Co^{2+}$ 이온의 첨가는 각각 약 25% 정도의 활성화 효과를 나타내는 반면, 본 효소의 pNPX에 대한 $K_{m}$은 2.75mM, pl값을 4.7, 그리고 분자량은 gel-filtration 법으로는 약 200,000dal., SDS-polyacrylamide gel 전기영동법으로는 약 66,000dal 으로 측정되어 세 개의 동일한 subunit로 구성된 효소 단백질인 것으로 추정되었다. 본 정제 효소는 xylobiose, xylotrioxe 및 xylotetraose 등의 xylo-oligosaccharide를 효과적으로 분해함은 물론이고, 분해율은 낮으나 birchwood xylan, larchwood xylan 및 oatspelt xylan 등의 xyland에도 작용, xylose 생산을 확인함으로써 본 효소는 그 예가 극히 드문 bacterial exo-xylanase인 것으로 분류되었다.
Endoglucanase gene egIV was cloned from Trichoderma viride AS 3.3711, an important cellulose-producing fungus, by using an RT-PCR protocol. The egIV cDNA is 1,297 bp in length and contains a 1,035 bp open reading frame encoding a 344 amino acid protein with an estimated molecular mass of 35.5 kDa and isoelectronic point (pI) of 5.29. The expression of gene egIV in T. viride AS 3.3711 could be induced by sucrose, corn straw, carboxymethylcellulose (CMC), or microcrystalline cellulose, but especially by CMC. The transcripts of egIV were regulated under these substrates, but the expression level of the egIV gene could be inhibited by glucose and fructose. Three recombinant vectors, pYES2-xegIV, $pYES2M{\alpha}$-egIV, and $pYES2M{\alpha}$-xegIV, were constructed to express the egIV gene in Saccharomyces cerevisiae H158. The CMCase activity of yeast transformants $IpYES2M{\alpha}$-xegIV was higher than that of transformant IpYES2-xegIV or $IpYES2M{\alpha}$-egIV, with the highest activity of 0.13 U/ml at induction for 48 h, illustrating that the modified egIV gene could enhance CMCase activity and that $MF{\alpha}$ signal peptide from S. cerevisiae could regulate exogenous gene expression more effectively in S. cerevisiae. The recombinant EGIV enzyme was stable at pH 3.5 to 7.5 and temperature of $35^{\circ}C$ to $65^{\circ}C$. The optimal reaction condition for EGIV enzyme activity was at the temperature of $55^{\circ}C$, pH of 5.0, 0.75 mM $Ba^{2+}$, and using CMC as substrate. Under these conditions, the highest activity of EGIV enzyme in transformant $IpYES2M{\alpha}$-xegIV was 0.18 U/ml. These properties would provide technical parameters for utilizing cellulose in industrial bioethanol production.
코로나바이러스감염증-19는 사람의 호흡기관에 다수로 분포하는 안지오텐신전환효소2, angiotensin converting enzyme 2 (ACE2)를 매개하여 감염을 일으키는 β-genus 바이러스이고 완치환자 및 백신 접종자의 항체생성에 대한 효율적인 사후관리가 필요한 질병을 유발하는 바이러스다. 이 논문에서는 임상 시료의 중화항체와 특이적으로 반응하는 재조합 단백질을 개발하고 이를 이용하여 COVID-19 바이러스에 대한 중화항체를 빠르고 편리하게 진단하는 신속 진단 키트를 개발하고 그것의 성능 평가를 통하여 제품화 가능성을 확인하는 것을 목표로 하였다. COVID-19 S1 RBD 재조합 단백질을 사용한 신속 진단 키트의 양성 퍼센트 일치(PPA) 및 음성 퍼센트 일치(NPA)가 미국 FDA EUA에서 승인한 ELISA 키트와 비교했을 때 각각 100% 및 98.3%인 점에서 신속 진단 키트에 적용할 수 있을 것으로 확인하였다. 향후 신속 진단 키트의 성능을 개선하고 정량 분석 장비를 통해 중화항체를 정량적으로 분석이 가능하면 제품화 통해 검체내의 중화항체 유무와 양을 확인함으로써 COVID-19 바이러스에 대한 면역성을 예측하고 추가 예방접종 여부를 판단하는 중요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각한다.
Embryonic stem cells (ESCs) have been used as a powerful tool for research including gene manipulated animal models and the study of developmental gene regulation. Among the critical regulatory factors that maintain the pluripotency and self-renewal of undifferentiated ESCs, NANOG plays a very important role. Nevertheless, because pluripotency maintaining factors and specific markers for livestock ESCs have not yet been probed, few studies of the NANOG gene from domestic animals including bovine have been reported. Therefore, we chose mouse ESCs in order to understand and compare NANOG expression between bovine, human, and mouse during ESCs differentiation. We cloned a 600 bp (-420/+181) bovine NANOG 5'-flanking region, and tagged it with humanized recombinant green fluorescent protein (hrGFP) as a tracing reporter. Very high GFP expression for bovine NANOG promoter was observed in the mouse ESC line. GFP expression was monitored upon ESC differentiation and was gradually reduced along with differentiation toward neurons and adipocyte cells. Activity of bovine NANOG (-420/+181) promoter was compared with already known mouse and human NANOG promoters in mouse ESC and they were likely to show a similar pattern of regulation. In conclusion, bovine NANOG 5-flanking region functions in mouse ES cells and has characteristics similar to those of mouse and human. These results suggest that bovine gene function studied in mouse ES cells should be evaluated and extrapolated for application to characterization of bovine ES cells.
KO mice provide an excellent tool to determine roles of specific genes in biomedical filed. Traditionally, knockout mice were generated by homologous recombination in embryonic stem cells. Recently, engineered nucleases, such as zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), were used to produce knockout mice. This new technology is useful because of high efficiency and ability to generate biallelic mutation in founder mice. Until now, most of knockout mice produced using engineered nucleases were C57BL/6 strain. In the present study we used CRISPR-Cas9 system to generate knockout mice in FVB strain. We designed and synthesized single guide RNA (sgRNA) of CRISPR system for targeting gene, Abtb2. Mouse zygote were obtained from superovulated FVB female mice at 8-10 weeks of age. The sgRNA was injected into pronuclear of the mouse zygote with recombinant Cas9 protein. The microinjected zygotes were cultured for an additional day and only cleaved embryos were selected. The selected embryos were surgically transferred to oviduct of surrogate mother and offsprings were obtained. Genomic DNA were isolated from the offsprings and the target sequence was amplified using PCR. In T7E1 assay, 46.7% among the offsprings were founded as mutants. The PCR products were purified and sequences were analyzed. Most of the mutations were founded as deletion of few sequences at the target site, however, not identical among the each offspring. In conclusion, we found that CRISPR system is very efficient to generate knockout mice in FVB strain.
The $P_{entC}$ promoter of the entCERA operon encoding enzymes for enterobactin biosynthesis in Escherichia coli is tightly regulated by the availability of iron in the culture medium. In iron-rich conditions, the $P_{entC}$ promoter activity is strongly repressed by the global transcription regulator Fur (ferric uptake regulator), which complexes with ferrous ions and binds to the Fur box 19-bp inverted repeat. In this study, we have constructed the expression vector pOS2 containing the $P_{entC}$ promoter and characterized its repression, induction, and modulation by quantifying the expression of the lacZ reporter gene encoding $\beta$-galactosidase. $\beta$-Galactosidase activities of E. coli transformants harboring pOS2-lacZ were highly induced in the presence of divalent metal ion chelators such as 2,2'-dipyridyl and EDTA, and were strongly repressed in the presence of excess iron. It was also shown that the basal level $\beta$-galactosidase expression by the $P_{entC}$ promoter was drastically decreased by incorporating the fur gene into the expression vector. Since the newly developed iron chelator-inducible expression system is efficient and cost-effective, it has wide applications in recombinant protein production.
Leptin is the adipocyte-specific product of the obese gene and plays a major role in food intake and energy metabolism. Leptin research was mainly focused on mammalian species, but understanding of leptin and its function in poultry is very poor. In this study, the duck leptin gene was amplified using the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) from duck liver RNA. The cDNA fragment was inserted into the pET-28a expression vector, and the resulting plasmid was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Experimental mice were given an intraperitoneal injection of 10 mg/kg leptin dissolved in phosphate buffered saline (PBS), while the control mice were injected with PBS. The effect of leptin on food intake, body weight and fatty deposition in mice was detected. Sequence analysis revealed that duck leptin had a length of 438 nucleotides which encoded a peptide with 146 amino acid residues. The sequence shares highly homology to other animals. The coding sequence of duck leptin was 84 and 86% identical to human and pig leptin nucleotides sequence. Highest identity was with the rat coding sequence (95%). The identity of the amino acid sequence was 84, 82 and 96% respectively compared to that of the human, pig and rat. Results of SDS-PAGE analysis indicated that a fusion protein was specifically expressed in E. coli BL21 (DE3). The purified product was found to be biologically active during tests. Continuous administration of recombinant duck leptin inhibited food intake. Despite the decrease of food intake, leptin significantly induced body weight and fatty deposition. These changes were accompanied by a significant down-secretion of plasma glucose, cholesterol, triglyceride and insulin levels in mice. The observations provide evidence for an inhibitory effect of leptin in the regulation of food intake and for a potential role of duck leptin in the regulation of lipogenesis.
본 연구에서는 Pluronic F-68을 해동 후 회복배지에 적용하여, 동결보존된 형질전환 식물세포의 생장 증진을 도모하였다. Pluronic F-68은 세포표면의 소수성을 감소시켰을 뿐만 아니라, 세포의 투과성을 증진시켜 세포와 직접 상호 작용할 수 있음을 관찰하였다. 또한 Pluronic F-68의 첨가에 의해 재조합단백질의 발현에 부정적인 영향을 보이지 않음을 확인하였다. 따라서 동결보존시 해동 후 회복배지에 Pluronic F-68의 첨가는 식물세포의 신속하고 효율적인 대량 현탁배양을 가능하게 할 수 있다.
Acetyl xylan esterase (AXE), which hydrolyzes the ester linkages of the naturally acetylated xylan and thus known to have an important role for hemicellulose degradation, was isolated from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontatlis PMA02, heterologously expressed in Escherichi coli (E.coli) and characterized. The full-length cDNA encoding NfAXE1 was 1,494 bp, of which 978 bp constituted an open reading frame. The estimated molecular weight of NfAXE1 was 36.5 kDa with 326 amino acid residues, and the calculated isoelectric point was 4.54. The secondary protein structure was predicted to consist of nine ${\alpha}$-helixes and 12 ${\beta}$-strands. The enzyme expressed in E.coli had the highest activity at $40^{\circ}C$ and pH 8. The purified recombinant NfAXE1 had a specific activity of 100.1 U/mg when p-nitrophenyl acetate (p-NA) was used as a substrate at $40^{\circ}C$, optimum temperature. The amount of liberated acetic acids were the highest and the lowest when p-NA and acetylated birchwood xylan were used as substrates, respectively. The amount of xylose released from acetylated birchwod xylan was increased by 1.4 fold when NfAXE1 was mixed with xylanase in a reaction cocktail, implying a synergistic effect of NfAXE1 with xylanase on hemicellulose degradation.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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