• 한국해양생명과학회지
• /
• 제1권2호
• /
• pp.79-87
• /
• 2016

카드뮴과 같은 중금속은 독성이 높아 수서 생물과 인간에게 해로운 영향을 미친다고 알려져 있다. 본 연구에서는 해양 섬모충 Euplotes crassus에서 카드뮴이 해독 기전에 관여하는 ABC transporters (ABCs)와 glutathione S-transferase (GST)의 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 총 7개의 ABCs 유전자와 1개의 GST 유전자 일부를 클로닝하여 유전자 분석을 실시하였고, 카드뮴(0.1~1 mg/l) 노출에 따른 이들 유전자의 발현 양상을 quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR)을 이용하여 분석하였다. 염기서열 분석과 계통 분석 결과 이들 ABCs 유전자가 ABC transporter의 특징을 가지며, ABC-B/C family에 속하는 것을 확인하였고, GST 유전자는 theta isoform과 유사한 것으로 나타났다. 카드뮴에 8시간 노출시킨 결과 ABC transporter 유전자의 경우 ABCB21 유전자를 제외하고는 대부분 농도 의존적으로 유전자 발현이 유의하게 증가하였다. GST 유전자는 0.5 mg/l에서 가장 높은 유전자 발현 양상을 보였으며, 1 mg/l에서는 발현량이 대조군 수준으로 감소되었다. 본 연구 결과는 E. crassus의 ABC transporter와 GST 유전자가 카드뮴에 의해 유도되는 독성에 대한 방어 기전에 참여하는 것을 의미한다.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제35권1호
• /
• pp.1-8
• /
• 2011

Techniques to evaluate gene expression profiling, such as sufficiently sensitive cDNA microarrays or real-time quantitative PCR, are efficient methods for monitoring human pluripotent stem cell (hESC/iPSC) cultures. However, most of these high-throughput tests have a limited use due to high cost, extended turn-around time, and the involvement of highly specialized technical expertise. Hence, there is an urgency of rapid, cost-effective, robust, yet sensitive method development for routine screening of hESCs/hiPSCs. A critical requirement in hESC/hiPSC cultures is to maintain a uniform undifferentiated state and to determine their differentiation capacity by showing the expression of gene markers representing all three germ layers, including ectoderm, mesoderm, and endoderm. To quantify the modulation of gene expression in hESCs/hiPSC during their propagation, expansion, and differentiation via embryoid body (EB) formation, we developed a simple, rapid, inexpensive, and definitive multimarker, semiquantitative multiplex RT-PCR platform technology. Among the 9 gene primers tested, 5 were pluripotent markers comprising set 1, and 3 lineage-specific markers were combined as set 2, respectively. We found that these 2 sets were not only effective in determining the relative differentiation in hESCs/hiPSCs, but were easily reproducible. In this study, we used the hES/hiPS cell lines to standardize the technique. This multiplex RT-PCR assay is flexible and, by selecting appropriate reporter genes, can be designed for characterization of different hESC/hiPSC lines during routine maintenance and directed differentiation.

• The Plant Pathology Journal
• /
• 제39권4호
• /
• pp.309-318
• /
• 2023

Huanglongbing (HLB) is one of the most destructive diseases in citrus, which imperils the sustainability of citriculture worldwide. The presumed causal agent of HLB, 'Candidatus Liberibacter asiaticus' (CLas) is a non-culturable phloem-limited α-proteobacterium transmitted by Asian citrus psyllids (ACP, Diaphorina citri Kuwayama). A widely adopted method for HLB diagnosis is based on quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). Although HLB diagnostic qPCR provides high sensitivity and good reproducibility, it is limited by time-consuming DNA preparation from plant tissue or ACP and the requirement of proper lab instruments including a thermal cycler to conduct qPCR. In an attempt to develop a quick assay that can be deployed in the field for CLas detection, we developed a real-time loop-mediated isothermal amplification (rt-LAMP) assay by targeting the CLas five copy nrdB gene. The rt-LAMP assay using various plant sample types and psyllids successfully detected the nrdB target as low as ~2.6 Log10 copies. Although the rt-LAMP assay was less sensitive than laboratory-based qPCR (detection limit ~10 copies), the data obtained with citrus leaf and bark and ACP showed that the rt-LAMP assay has >96% CLas detection rate, compared to that of laboratory-based qPCR. However, the CLas detection rate in fibrous roots was significantly decreased compared to qPCR due to low CLas titer in some root DNA sample. We also demonstrated that the rt-LAMP assay can be used with a crude leaf DNA extract which is fully deployable in the field for quick and reliable HLB screening.

• 한국식품위생안전성학회지
• /
• 제33권1호
• /
• pp.71-76
• /
• 2018

노로바이러스는 전 세계적으로 산발적인 발병 관련 비세균성 위장염의 주요 원인 물질이다. 노로바이러스 검출을 위해 역전사 실시간 PCR (RT qPCR)이 그 민감도와 특이성으로 인해 주요 수단으로 빠르게 자리 잡았다. 그러나 RT qPCR 분석을 위해서는 정확한 바이러스 RNA 추출방법이 필수적이다. TRIzol 시약은 생물학적 물질로부터 RNA의 추출에 이용되고 따라서 노로바이러스 RNA 추출에도 널리 사용된다. 이 연구에서는 인체 노로바이러스 유전체 그룹 I (GI) 및 유전자 그룹 II (GII)와 생쥐 노로바이러스(GV) 중에서 GII로부터의 TRIzol 을 이용한 바이러스 RNA의 추출률이 바이러스 시료 용액의 pH에 의존했다는 내용이 다루어졌다. 실시간 PCR의 Ct값으로 비교한 RNA 추출 수율은 산성 영역보다 알칼리성 pH에서 높았다. 이 연구 결과로 부터 TRIzol을 이용하여 GII RNA를 추출하여 노로바이러스를 정량적으로 분석할 때 pH조건이 대단히 중요하다는 것을 알 수 있었다.

• 대한화장품학회지
• /
• 제39권4호
• /
• pp.281-288
• /
• 2013

히알루론산(HA)은 피부의 세포외기질을 구성하는 주성분이다. 인간의 피부에서 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되어 있으며, 이것은 노화에 따른 피부 수분 감소, 주름 형성 및 피부 탄력 저하에 관여한다고 알려져 있다. 지금까지 밝혀진 히알루론산 합성효소(hyaluronan synthase, HAS)들 중에 HAS-2가 사람의 피부 섬유아세포에서의 히알루론산의 합성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 천궁으로부터 분리된 ferulic acid가 사람의 피부 유래 섬유아세포에서 히알루론산의 생성에 미치는 효과를 확인하였다. Semi-quantitative RT-PCR과 quantitative real-time PCR을 통해 ferulic acid가 HAS-2의 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며 ELISA assay를 통해 ferulic acid가 히알루론산의 생성을 증가시키는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 ferulic acid는 피부 노화에 따른 히알루론산의 감소에 의해 나타나는 건조, 주름 및 탄력 저하와 같은 현상을 개선시킬 가능성을 가진 물질임을 확인하였다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
• /
• 제20권2호
• /
• pp.184-193
• /
• 2007

In mammalian ovary, steroidogenic acute regulatory (StAR) protein mediates the true rate-limiting step of transport of cholesterol from outer to inner mitochondrial membrane. Appropriate expression of StAR gene represents an indispensable component of steroidogenesis and its regulation has been found to be species specific. However, limited information is available regarding StAR gene expression during estrous cycle in buffalo ovary. In the present study, expression, localization and hormonal regulation of StAR mRNA were analyzed by semi-quantitative RT-PCR in buffalo ovary and partial cDNA was cloned. Total RNA was isolated from whole follicles of different sizes, granulosa cells from different size follicles and postovulatory structures like corpus luteum and Corpus albicans. Semi-quantitative RT-PCR analyses showed StAR mRNA expression in the postovulatory structure, corpus luteum. No StAR mRNA was detected in total RNA isolated from whole follicles of different size including the preovulatory follicle (>9 mm in diameter). However, granulosa cells isolated from preovulatory follicles showed the moderate expression of StAR mRNA. To assess the hormonal regulation of StAR mRNA, primary culture of buffalo granulosa cells were treated with FSH (100 ng/ml) alone or along with IGF-I (100 ng/ml) for 12 to 18 h. The abundance of StAR mRNA increased in cells treated with FSH alone or FSH with IGF-I. However, effect of FSH with IGF-I on mRNA expression was found highly significant (p<0.01). In conclusion, differential expression of StAR messages was observed during estrous cycle in buffalo ovary. Also, there was a synergistic action of IGF-I on FSH stimulation of StAR gene.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
• /
• 제15권4호
• /
• pp.1675-1679
• /
• 2014

Objectives: MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of many physiological and pathological processes, including tumorigenesis and metastasis. In this study, we sought to determine the underlying molecular mechanisms of metastatic cervical carcinoma by performing miRNA profiling. Methods: Tissue samples were collected from ten cervical squamous cancer patients who underwent hysterectomy and pelvic lymph node (PLN) dissection in our hospital, including four PLN-positive (metastatic) cases and six PLN-negative (non-metastatic) cases. A miRNA microarray platform with 1223 probes was used to determine the miRNA expression profiles of these two tissue types and case groups. MiRNAs having at least 4-fold differential expression between PLN-positive and PLN-negative cervical cancer tissues were bioinformatically analyzed for target gene prediction. MiRNAs with tumor-associated target genes were validated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Thirty-nine miRNAs were differentially expressed (>4-fold) between the PLN-positive and PLN-negative groups, of which, 22 were up-regulated and 17 were down-regulated. Sixty-nine percent of the miRNAs (27/39) had tumor-associated target genes, and the expression levels of six of those (miR-126, miR-96, miR-144, miR-657, miR-490-5p, and miR-323-3p) were confirmed by quantitative (q)RT-PCR. Conclusions: Six MiRNAs with predicted tumor-associated target genes encoding proteins that are known to be involved in cell adhesion, cytoskeletal remodeling, cell proliferation, cell migration, and apoptosis were identified. These findings suggest that a panel of miRNAs may regulate multiple and various steps of the metastasis cascade by targeting metastasis-associated genes. Since these six miRNAs are predicted to target tumor-associated genes, it is likely that they contribute to the metastatic potential of cervical cancer and may aid in prognosis or molecular therapy.

• Journal of Genetic Medicine
• /
• 제19권2호
• /
• pp.63-75
• /
• 2022

Purpose: Osteoporosis is a common calcium and metabolic skeletal disease which is characterized by decreased bone mass, microarchitectural deterioration of bone tissue and impaired bone strength, thereby leading to enhanced risk of bone fragility. In this study, we aimed to identify novel genes for susceptibility to osteoporosis and/or bone density. Materials and Methods: To identify differentially expressed genes (DEGs) between control and osteoporosis-induced cells, annealing control primer-based differential display reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was carried out in pre-osteoblast MC3T3-E1 cells. Expression levels of the identified DEGs were evaluated by quantitative RT-PCR. Association studies for the quantitative bone density analysis and osteoporosis case-control analysis of single nucleotide polymorphism (SNPs) were performed in Korean women (3,570 subjects) from the Korean Association REsource (KARE) study cohort. Results: Comparison analysis of expression levels of the identified DEGs by quantitative RT-PCR found seven genes, Anxa6, Col5a1, Col6a2, Eno1, Myof, Nfib, and Scara5, that showed significantly different expression between the dexamethason-treated and untreated MC3T3-E1 cells and between the ovariectomized osteoporosis-induced mice and sham mice. Association studies revealed that there was a significant association between the SNPs in the five genes, ANXA6, COL5A1, ENO1, MYOF, and SCARA5, and bone density and/or osteoporosis. Conclusion: Using a whole-genome comparative expression analysis, gene expression evaluation analysis, and association analysis, we found five genes that were significantly associated with bone density and/or osteoporosis. Notably, the association P-values of the SNPs in the ANXA6 and COL5A1 genes were below the Bonferroni-corrected significance level.

• 공업화학
• /
• 제33권3호
• /
• pp.235-241
• /
• 2022

유엔이 발표한 세계 물개발 보고서는 2030년까지 식수가 현재보다 40% 감소할 것으로 전망하고 있다. 이는 물의 양이 감소하는 것이 아니라, 환경오염으로 인해 상수원이 오염되는 것을 말한다. 미생물이 수질에 깊은 연관이 있기 때문에 미생물의 분석은 수질관리에 매우 중요하다. 현재 미생물 분석에 사용되는 방법은 배양 후 현미경을 통한 모양과 형태를 분석하는 것이 가장 일반적이나, 유전자분석 기술이 발달함에 따라 현미경을 통한 미생물 분석 방식에 qPCR(quantitative polymerase chain reaction) 적용이 가능해졌고 활용방법 등이 연구되었다. 그 중에는 역전사 단계를 추가하여 RNA 분석에 용이성을 부여한 RT-qPCR법과 미생물 배양분석에 접목시켜 검사시간을 단축시키는 ICC-qPCR, 자연에서 채취한 샘플의 위양성율을 감소시키는 데 용이한 viability qPCR, 다중분석에 용이한 multiplex qPCR, 소량의 샘플만으로 분석이 가능한 microfluidic qPCR법 등이 있다. 본 논문에서는 이처럼 qPCR 방법이 미생물 분석에 적용되는 사례와 방식의 원리, 그리고 발전 방향에 대해 소개하고자 한다.

• 대한소아치과학회지
• /
• 제45권1호
• /
• pp.32-40
• /
• 2018

본 연구는 치태의 성숙도에 따라 치태를 서로 다른 색상으로 염색하는 GC Tri Plaque ID $Gel^{TM}$(GC corporation, Tokyo, Japan)을 이용하여 치아 우식 위험도를 평가하고자 하였다. 치아 우식의 발생 및 진행과 연관된 균인 Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spp.의 수를 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)로 측정하여 치아 우식 위험도를 보았다. 본 실험은 강릉원주대학교 치과병원 임상시험 심사위원회의 심의를 받고 진행하였다. 강릉원주대학교 치과병원 소아치과에 내원한 전신질환이 없는 건강한 9 - 12세의 초등학생 15명의 치면을 착색제로 염색하였다. 치태의 성숙도에 따라 서로 다른 세가지 색상으로 염색되었으며 색상별로 3개의 실험군인 I군(pink/red), II군(blue/purple), III군(light blue)으로 나누었다. 3개의 실험군에서 각각 DNA를 추출한 후, qRT-PCR을 이용하여 S. mutans, S. sobrinus, Lactobacillus spp.의 수를 측정하였다. 3개의 실험군 사이에 S. mutans, S. sobrinus와 Lactobacillus spp. 균 수의 유의한 차이가 관찰되었으며 3종류의 균 모두 III군에서 가장 많이 관찰되었다(p < 0.05). GC Tri Plaque ID $Gel^{TM}$는 기존 착색제와는 달리 치태의 성숙도에 따라 서로 다른 세가지 색상으로 염색되며, 치태 염색 색상의 차이는 치아 우식 관련 균 수의 차이를 보여주었다. GC Tri Plaque ID $Gel^{TM}$이 치아 우식 위험도를 평가하는 하나의 지표로서 사용될 수 있는 가능성을 확인하였다.