• 한국동물학회지
• /
• 제28권1호
• /
• pp.31-43
• /
• 1985

$(Ca^{2+}+Mg^{2+})$-ATPase를 쥐의 근소포체로부터 sucrose density gradient centrifugation의 방법을 사용하여 분리 정제하였다. 정제된 효소를 폴리아크릴 아마이드 젤에서 전기영동한 결과, 토끼와 닭의 경우에서와 같이 분자량 115,000인 단일 단백질 띠로 나타났다. 정제된 이 효소의 활설도는 50 $\\muM$의 $Mg^{2+}, Ca^{2+}, Co^{2+}, Fe^{2+}, Min^{2+}$에 의해서는 증가되었고, 같은 농도의 $Zn^{2+}, Cu^{2+}, Hg^{2+}$에 의해서는 감소되었다. Quinine와 quinacrine 같은 antimalarial drug는 이 효소의 활성도에 큰 영향을 주지 않았으나, p-hydroxymercuric benzoate와 phenylmethylsulfonylfluoride는 이 효소의 활성을 억제하였다. 이 효소는 pH 6과 7 사이에서 가장 높은 활성을 나타내었고, ATP를 기질로 사용하였을 때 Km 값은 98 $\\muM$이었다. $(Ca^{2+}+Mg^{2+})$-ATPase는 microsomal fraction에서 선택적으로 분해되었다. $^{3}H-casein$ 이나 ^{125}I-insulin같은 방사성 동위원소로 표지된 기질을 사용하여 단백질 분해에 대한 활성도를 조사해 본 결과, microsomal preparation에 metalloendoprotease가 존재하였다. 그러나 아직까지는 그 효소가 $(Ca^{2+}+Mg^{2+})$-ATPase를 분해하는지는 확실하지 않다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제46권2호
• /
• pp.79-83
• /
• 2003

난균류에 속하는 Phytophthora spp.와 pythium spp.에서 분비되는 단백질인 elicitin은 식물과 병원균과의 비친화적 관계에서 과민감반응을 유도하는 인자로 알려져 왔다. 국내에서 수집된 5종의 Phytophthora spp로부터 분리된 elicitin들은 무, 배추, 고추에서 과민감 반응을 유도 하였으나 오이, 토마토에서는 볼 수 없었다. 특히 지금까지 보고가 되지않은 P. cambivora KACC 40160균주의 배양액으로부터 ion exchange와 gel filtration을 이용하여 고추에 과민감반응을 유도하며 분자량이 10kDa인 새로운 elicitin을 순수분리 하여 cambivorein이라 명명 하였다. 분리된 cambivorein의 N-말단 아미노산 서열분석 결과 ${\beta}-isoform$의 특징인 13번째 아미노산이 Iysine을 가지고 있었으며 기존의 다른 종류의 elicitin과는 다른 아미노산으로 구성되어 있었다.

• Journal of Yeungnam Medical Science
• /
• 제3권1호
• /
• pp.41-48
• /
• 1986

사람의 적혈구막으로부터 Band 3를 분리정제하고 이를 liposome 내로 도입시켜 그 결과를 관찰하였다. 적혈구를 약알칼리 저장액으로 용혈시켜 막을 분리한 후, 저이온강도 용액으로 처리하여 Band 4를 추출하였다. Triton X-100 추출액에 p-chloromercuribenzoate를 가하고 sucrose density gradient ultracentrifugation후 fractionation하여 Band 3를 정제하였다. phosphatidyl L-serine과 cholesterol을 1 : 1 molar ratio로 섞고 진공회전 증발기를 사용하여 chloroform을 제거한 후 Triton X-100을 제거한 Band 3용액을 가하고 sonication함으로 liposome(reverse-phase evaporation vesicle)을 만들면서 Band 3를 도입 시켰다 Band 3의 분리정제 및 liposome에 도입되었음은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영 동 후 coomassie brilliant blue 염색으로 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
• /
• 제20권6호
• /
• pp.838-844
• /
• 2010

토양에서 생육하는 Streptomyces corcohrussi의 혈전용해효소가 DEAE-Sephadex A-50 그리고 Sephadex G-50 젤 여과를 이용한 크로마토그라피 방법에 의해 순수분리 되었다. SDS-PAGE 분석결과, 분리된 효소는 단일 단백질이고, 그 분자량은 약 34 kDa 이라는 것을 알 수 있었다. 순수분리된 효소의 혈전용해활성은 plasminogen-rich fibrin plate에서 0.8 U/ml 이었으나, plasminogen-free fibrin plate 에서의 그 효소활성은 0.36 U/ml 이하이었다. 이러한 결과로, 순수 분리된 효소가 plasminogen activator 로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 단백질 저해제인 $\varepsilon$-ACA, t-AMCHA 와 mercuric chloride의 존재시에 그 혈전용해활성은 24% 이하이었는데, 이러한 결과는 이들 plasmin 저해제 그리고(혹은) fibrinogen을 fibrin으로 전환시키는 과정과 관련된 fibrinogen 저해제에 의해 이 효소가 조절될 수 있음을 나타낼 수 있다. 한편으로, 중금속 이온인 $Zn^{2+}$은 그 활성을 58% 감소시켰다. 순수 분리된 효소의 최적 온도는 약 $50^{\circ}C$ 이었고, 그 효소활성의 92% 이상은 pH 5.0과 8.0 사이에서 유지되었다. 그러므로, 이러한 결과들은 하나의 강력한 혈전용해효소를 제공해서, S. corcohrussi 유래 새로운 혈전용해제의 개발에 기여하도록 한다.

• 대한방사성의약품학회지
• /
• 제5권1호
• /
• pp.18-25
• /
• 2019

2-Nitroimidazole derivatives have been reported to accumulate in hypoxic tissue. We prepared a novel $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole and evaluated the feasibility for hypoxia imaging agent. $Bz-MAG_3$-2-nitroimidazole was synthesized by direct coupling of $Bz-MAG_3$ and 2-nitroimidazole using dicyclohexylcarbodiimide. $Bz-MAG_3$-2-nitroimidazole was labeled with $^{99m}Tc$ in the presence of tartaric acid and $SnCl_2-2H_2O$ at $100^{\circ}C$ for 30 min. And the reaction mixture was purified by $C_{18}$ Sep-pak cartridge. The labeling efficiency and the radiochemical purity were checked by ITLC-SG/acetonitrile. The tumor was grown in balb/c mice for 8~13 days after the subcutaneous injection of tumor cells, CT-26 (murine colon adenocarcinoma cell). Biodistribution study and tumor autoradiography were performed in the xenografted mice after i.v injection of 74 kBq/0.1 mL and 19 MBq/0.1 mL of $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole, respectively. In vivo images of $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole in tumor bearing mice were obtained 1.5 hr post injection. The labeling efficiency was $45{\pm}20%$ and the radiochemical purity after purification was over 95%. Paper electrophoresis confirmed negative charge of $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole. $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole was very stable at room temperature and its protein binding was 53%. The $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole exhibited high uptake in the liver, stomach and intestine. In biodistribution study using tumor bearing mice, the uptakes (% ID/g) of the tumor were $0.5{\pm}0.1$, $0.4{\pm}0.0$, $0.2{\pm}0.1$ and $0.1{\pm}0.1$ at 5, 15, 30 min and 4 hrs. Tumor/muscle ratio were $1.4{\pm}0.1$, $2.2{\pm}0.83$, $3.0{\pm}0.9$, and 3.7 (n=2) for 5, 15, 30 min and 4 hrs. The uptake in hypoxic area was found higher than in non-hypoxic area of tumor tissue by autoradiography. In vivo images showed the relatively faint uptake to the hypoxic tumor region. $^{99m}Tc-MAG_3$-2-nitroimidazole was successfully synthesized and found feasible for imaging hypoxia.

• 한국균학회지
• /
• 제22권4호
• /
• pp.298-308
• /
• 1994

Ganoderma lucidum이 생산하는 polygalacturonase의 유용활용 방안을 위한 효소의 특성을 연구하기 위하여 버섯배양물로부터 효소를 생산하고 정제하여 그 특성을 검토한 결과는 다음과 같다. Endo-polygalacturonase는 배양여액으로부터 ammonium sulfate 침전, Biogel P-100, DEAE-cellulose, Sehpadex G-150 column chromatography에 의하여 순차적으로 정제되었고, Sehpadex G-150 column chromatography에서 re-gel filtration까지 실시한 결과 specific activity가 892unit/mg protein로 배양여액보다도 약 56배의 정제도를 나타냈으며, exo-polygalacturonase는 ammonium sulfate침전, Biogel P-100, DEAE-cellulose column chromatography까지 부분정제한 결과 9.2배의 정제도를 나타냈다. SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시한 결과 단일 band를 나타냈으며, 분자량은 54,000 dalton이었다. Endo-polygalacturonase와 exo-polygalacturonase는 citrus pectin이나 pectic acid보다 apple pectin에 친화도가 높았으며, Lineweaver-Burk plot로부터 계산된 apple pectin에 대한 Km 치는 각각 1.44와 10.6 mg/ml이었다. 이 두 효소의 작용 최적 pH는 4.0이었으나 pH 안정성에서는 endo-polygalacturonase는 $pH\;4.0{\sim}6.0$에서, exo-polygalacturonase는 $pH\;3.5{\sim}5.5$ 범위에서 안정하였다. 효소반응 최적 온도는 endo-polygalacturonase는 $40^{\circ}C$ 이었으나 exo-polygalacturonase는 $60^{\circ}C$에서 최대의 활성을 나타냈고 열안정성도 exo-polygalacturonase가 endo-polygalacturonase보다 더 높은 온도에서도 안정하였다. 또한 endo-polygalacturonase는 $Ca^{++}$ 과 $Mn^{++}\;ion$에, exo-polygalacturonase에는 $Ca^{++}\;ion$에 의해 효소반응이 촉진되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제22권3호
• /
• pp.292-300
• /
• 2012

We report the expression, purification, and characterization of L-asparaginase (AnsA) from Rhizobium etli. The enzyme was purified to homogeneity in a single-step procedure involving affinity chromatography, and the kinetic parameters $K_m$, $V_{max}$, and $k_{cat}$ for L-asparagine were determined. The enzymatic activity in the presence of a number of substrates and metal ions was investigated. The molecular mass of the enzyme was 47 kDa by SDS-PAGE. The enzyme showed a maximal activity at $50^{\circ}C$, but the optimal temperature of activity was $37^{\circ}C$. It also showed maximal and optimal activities at pH 9.0. The values of $K_m$, $V_{max}$, $k_{cat}$, and $k_{cat}/K_m$ were $8.9{\pm}0.967{\times}10^{-3}$ M, $128{\pm}2.8$ U/mg protein, $106{\pm}2s^{-1}$, and $1.2{\pm}0.105{\times}10^4M^{-1}s^{-1}$, respectively. The L-asparaginase activity was reduced in the presence of $Mn^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Ca^{2+}$, and $Mg^{2+}$ metal ions for about 52% to 31%. In addition, we found that $NH_4{^+}$, L-Asp, D-Asn, and ${\beta}$-aspartyl-hydroxamate in the reaction buffer reduced the activity of the enzyme, whereas L-Gln did not modify its enzymatic activity. This is the first report on the expression and characterization of the L-asparaginase (AnsA) from R. etli. Phylogenetic analysis of asparaginases reveals an increasing group of known sequences of the Rhizobial-type asparaginase II family.

• 생명과학회지
• /
• 제8권5호
• /
• pp.614-621
• /
• 1998

열안정성 inulinase를 분비하는 Penicillium sp.를 돼지 감자 서식지의 토양으로부터 분리하여 이 균주의 inulinase를 50%-80% 염석, DEAE-Sephacel column chromatography, Toyopearl HW 65 F column chromatography에 의해 정제하여 inulinase 활성을 가진 단일 band를 얻었다. 이 band의 단백질을 polya-cryamide gel electrophoresis 후 추출하여 inulinase 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 이 단백질의 분자량은 SDS-PAGE에 의해 약 77,000 dalton으로 추정되었고, 최종 정제도는 53.3배이었다. 정제된 효소의 효소학적 성질을 조사한 결과, 최적온도는 약 6$0^{\circ}C$이었고, 열 안정성은 30-5$0^{\circ}C$에서 비교적 안정하였다. pH 4에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH 4-5에서는 비교적 안정했고 염기성에서는 아주 낮은 활성을 나타내었다. 금속이온과 다른 화학물질의 영향을 조사한 결과 1mM의 $MnCl_2$와 $CaCl_2$에 의해 활성이 증가했으며 특히, $MnCl_2$는 1.7배까지 활성을 증가시켰다. 그러나, 1mM의 $CuCl_2$,$HgCl_2$와 1mM EDTA 시에는 활성이 저해되었다. TLC분석결과 모든 산물이 monosaccharide였으므로 이 효소는 exo-acting inu-linase로 추정되었고, inulin에 대한 이 효소의 $K_M$치는 $2.2\times10^{-3}$이었다. 이 효소의 결정된 N-terminal 아미노산 배열은 $NH_2$-X-Glu-Tyr-Thr-Glu-Lys/Leu-Tyr-Arg-Pro이다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제15권4호
• /
• pp.333-341
• /
• 1983

도토리 부패물로부터 분리한 Aspergillus sp, AN-11 균주가 분비하는 tannase를 일련의 ammonium S-ulfate에 의한 침전, DEAE-Cellulose Column Chromatography 및 Sephadex G-200 gel filtration 방법에 의하여 정제하여 물리화학적 성질을 규명하였다. 정제된 tannase 는 비활성(比活性)이 조(粗)tannase에 비하여 37 배정도 증가되었으며, 효소활성이 회수(回收)는 약 49%이었다. 정제된 tannase 는 polyacrylamide gel 전기영동에 의한 균일성을 나타내었고, SDS-polyacrylamide gel 전기영동에서는 단일 밴드를 형성하는 두개의 동일한 subunits로 분리되었으며, 본 도토리 tannin 분해효소의 분자량은 200,000 정도로 계산되었다. 정제된 tannase는 전형적인 단백질 UV흡수 스펙트럼을 나타내었으며, 한편 최적 pH 몇 온도는 5.5 와 $30{\sim}40^{\circ}C$이었고 pH $5.0{\sim}6.5$와 온도 $30^{\circ}C$ 이하의 범위 내에서 비교적 안정성을 보였으며, $CuCl_2$ 및 $ZnCl_2금속염에 의해서는 효소활성이 크게 저해되었다. 또한 정제된 tannase의 Km 값은 $7.58{\times}10^{-4}M$이었다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제49권3호
• /
• pp.329-336
• /
• 2021

Cellulophga sp. J9-3은 셀룰로스 분해능력을 갖으며, Flavobacteriaceae 과에 속하는 그람-음성 호기성 해양 세균이다. 또한, J9-3 균주는 고체 및 액체 배지에서 한천을 가수 분해 할 수 있으며, 배지에 첨가한 아가로스(agarose)에 의해 아가레이즈(agarase)의 생산이 현저하게 유도되는 특성을 보였다. Cellulophga sp. J9-3의 세포 배양액으로부터, 황산암모늄 침전 및 3 단계의 컬럼 크로마토그래피를 연속적으로 수행하여, 한 개의 agarase 단백질, AgaJ93을 순수하게 정제하였다. 정제된 AgaJ93은 아가로스에 대한 분해 활성이 가장 강하였으며, starch에 대해서도 아가로스 대비 약 22% 정도의 분해 활성을 나타냈다. AgaJ93은 아가로스를 분해하여 사이즈가 큰 올리고당 중간체를 경유하여, 최종산물로 네오아가로테트라오스와 네오아가로헥사오스까지 분해함을 확인하였으며, 이는 AgaJ93이 endo-type β-아가레이즈 임을 의미한다. AgaJ93은 pH 7.0, 35℃에서 최대 활성을 나타냈고, Co²⁺ 이온에 의해 6배 이상의 활성증가를 보였다. AgaJ93의 N-terminal sequence 분석 결과, AgaJ93은 Cellulophaga sp. W5C의 내열성 endo-type β-아가레이즈 Aga2와 82%의 상동성을 보였으나, 두 효소의 생화학적 특성이 달랐다. 따라서, AgaJ93은 기존에 보고된 β-아가레이즈 들과는 다른 신규의 아가레이즈 일 것으로 예상된다.