• KSBB Journal
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• 제21권2호
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• pp.144-150
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• 2006

본 연구는 메타게놈 유전자 특성과 E. coli에서 정상적으로 발현되는 유전자 특성을 생물정보학 기법으로 비교 분석하고 그 결과를 메타게놈 선별 연구에 활용하고자 하는데 그 목적을 두었다. 이를 위하여 메타게놈 유래의 URF 와 숙주세포로 이용되는 E. coli이 ORF에 대한 염기구조, 발현되는 단백질의 크기 및 분자량, 아미노산의 구성 및 코돈사용은 물론 전사와 번역에 관여하는 프로모터 부위와 리보솜 결합부위의 보존서열 특성을 비교 분석하였다. 메타게놈과 E. coli가 합성하는 단백질의 크기와 분자량은 매우 비슷한 경향을 보였으나, 아미노산의 조성비, G+C 함량 및 코돈사용에서는 매우 다른 경향을 나타내었다. 특히 전사와 번역에 직접적으로 관여하는 프로모터와 RBS 영역에서의 DNA 보존서열이 상당부분 부합되지 않아 E. coli에서 메타게놈의 발현율이 현저히 낮을 것으로 예측할 수 있었다. RBS와 같이 유전자 발현에 필수적인 조절인자가 메타게놈과 E. coli에서 큰 차이를 나타내는 문제점은 메타게놈으로부터 유용한 유전자원을 탐색하는 연구에서 심도있게 개선하여야 할 사항이다. 부분적으로는 라이브러리 구축에 사용되는 벡터 및 숙주의 개량을 통하여 위의 문제를 극복할 수도 있을 것이다.

• 생명과학회지
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• 제13권4호
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• pp.529-534
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• 2003

홍화씨가 골절, 골다공증 및 골형성부전증 등의 골 질환 치료에 효과가 있다는 것이 알려져 민간요법으로 사용되고 있으나 홍화씨의 어떤 성분이 이러한 작용을 하는지에 관해서는 거의 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 흥화씨의 sterol 조성을 분석하고 폐경기 여성들의 골다공증 치료에 사용되고 있는 합성 estrogen 대체물질로써 그 기능이 확인된 phytoestrogen 활성을 측정하였다. Cholesterol에서 성호르몬인 estrogen이 합성되는 것처럼 식물 sterol 도 phytoestrogen 합성을 위한 전구체 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 홍화씨에 존재하는 식물성 sterol은 stigmast-5-en-3-ol (3$\beta$, 24S)-form인 ${\gamma}$-sitosterol (clionasterol)로 확인되었으며 홍화에 존재하는 식물성 sterol의 함량은 총지질의 약 4%를 함유하였다. 홍화씨의 sterol 분석은 GC-MS와 Wiley MS spectrum library를 사용하여 분석하였으며 홍화씨에 존재하는 중요한 4-desmethyl sterols 에는 sitosterol 만이 확인되었다. 홍화씨의 식물성 estrogen 효과는 $\beta$-estradiol ($10^{-8}$ M)의 활성을 1로 했을 때 홍화씨의 에탄을 층(5 mg/ml) 및 메탄올 층(5 mg/ml)에서 각각 0.37과 0.43으로 estrogen 유사효과를 나타내었다(ANOVA p<0.001). 홍화씨에 포함된 estrogen에 의한 전사활성 촉진은 MCF7/pDS-CAT-ERE119-Ad2MLP system을 사용하여 estrogen수용체와 reporter gene 발현을 이용하는 방법으로 세포에 직접 처리함으로써 phytoestrogen 활성을 측정할 수 있었다.

• BMB Reports
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• 제56권10호
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• pp.563-568
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• 2023

DNA methylation regulates gene expression and contributes to tumorigenesis in the early stages of cancer. In colorectal cancer (CRC), CpG island methylator phenotype (CIMP) is recognized as a distinct subset that is associated with specific molecular and clinical features. In this study, we investigated the genome-wide DNA methylation patterns among patients with CRC. The methylation data of 1 unmatched normal, 142 adjacent normal, and 294 tumor samples were analyzed. We identified 40,003 differentially methylated positions with 6,933 (79.8%) hypermethylated and 16,145 (51.6%) hypomethylated probes in the genic region. Hypermethylated probes were predominantly found in promoter-like regions, CpG islands, and N shore sites; hypomethylated probes were enriched in open-sea regions. CRC tumors were categorized into three CIMP subgroups, with 90 (30.6%) in the CIMP-high (CIMP-H), 115 (39.1%) in the CIMP-low (CIMP-L), and 89 (30.3%) in the non-CIMP group. The CIMP-H group was associated with microsatellite instability-high tumors, hypermethylation of MLH1, older age, and right-sided tumors. Our results showed that genome-wide methylation analyses classified patients with CRC into three subgroups according to CIMP levels, with clinical and molecular features consistent with previous data.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제34권4호
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• pp.920-929
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• 2024

As a pivotal defensive line against multitudinous malignant tumors, natural killer (NK) cells exist in the tumor microenvironment (TME). RAD18 E3 Ubiquitin Protein Ligase (RAD18) has been reported to foster the malignant progression of multiple cancers, but its effect on NK function has not been mined. Here, the study was designed to mine the mechanism by which RAD18 regulates the killing effect of NK cells on colorectal cancer (CRC) cells. Expression of E2F Transcription Factor 7 (E2F7) and RAD18 in CRC tissues, their correlation, binding sites, and RAD18 enrichment pathway were analyzed by bioinformatics. Expression of E2F7 and RAD18 in cells was assayed by qRT-PCR and western blot. Dual-luciferase assay and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay verified the regulatory relationship between E2F7 and RAD18. CCK-8 assay was utilized to assay cell viability, colony formation assay to detect cell proliferation, lactate dehydrogenase (LDH) test to assay NK cell cytotoxicity, ELISA to assay levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ), and immunofluorescence to detect expression of toxic molecules perforin and granzyme B. High expression of RAD18 and E2F7 was found in CRC tissues and cells. Silencing RAD18 could hamper the proliferation of CRC cells, foster viability and cytotoxicity of NK cells, and increase the secretion of GM-CSF, TNF-α, IFN-γ as well as the expression of perforin and granzyme B. Additionally, ChIP and dual-luciferase reporter assay ascertained the binding relationship between RAD18 promoter region and E2F7. E2F7 could activate the transcription of RAD18, and silencing RAD18 reversed the inhibitory effect of E2F7 overexpression on NK cell killing. This work clarified the inhibitory effect of the E2F7/RAD18 axis on NK cell killing in CRC, and proffered a new direction for immunotherapy of CRC in targeted immune microenvironment.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권3호
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• pp.153-158
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• 2008

형질 전환 동물 생산에는 조직 및 시기 특이적 발현 조절이 가능하다는 장점 때문에 유즙 내로 외부 유전자를 발현시키는 시스템이 널리 이용되고 있다. 유전자 발현 즉, 단백질 생산은 프로모터의 강도뿐만 아니라 mRNA의 안정성에 의해서도 조절된다. 특히, polyadenylation에 의한 poly A의 길이는 in vivo와 올 in vitro에서 mRNA 안정성 및 목적 유전자의 번역효율에 영향을 준다. 본 연구에서는 이러한 mRNA 안정성이 목적 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3'-UTR 염기 서열을 분석하였다. 이 3'-untranslated region(UTR) 내의 poly A signal을 기준으로 putative cytoplasmic polyadenylation element(CPE) 부위와 downstream elements(DSE: U-rich, G-rich, GU-rich)의 염기 서열을 분석하고, 각각의 element를 기준으로 15 종의 luciferase reporter vector를 제작하여, 생쥐 유선 세포주(HC11)와 돼지 유선 세포주(PMGC)에 각각 transfection시킨 후 48시간 동안 배양하고 luciferase 발현량을 분석하였다. PMGC의 경우, luciferase의 발현은 exon 9의 CPE 2,3 및 DSE 1을 포함한 #6 construct에서 유의적으로 높은 발현량을 보였으며, exon 9의 CPE 2, 3과 DSE를 모두 포함하고 있는 #11 construct에서도 유의적으로 높은 발현량을 보였다. 이러한 결과는 형질 전환 돼지 생산에 있어 #6 및 11 construct의 사용은 목적의 유전자를 효과적으로 발현시키는데 기여할 것으로 사료된다.

• 생명과학회지
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• 제26권4호
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• pp.414-418
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• 2016

본 연구에서는 제주흑돼지와 랜드레이스 품종 사이에서 생산된 F₂ 교배 집단의 경제형질과 isocitrate dehydrogenase 3, beta subunit (IDH3B) 유전자의 유전적 다형성의 상관관계를 시험하였다. IDH3B 유전자의 프로모터 지역에서 304-bp 삽입/결실 돌연변이를 기준으로 전체 1,105 F₂들에 유전자형 분석에 이용하였다. 기초축군과 F₁, F₂에서 세 가지 유전자형(AA, AB, BB)이 모두 발견되었다. 통계적 상관 분석결과에서 도체중(CW), 세 지점(4-5번 흉추 사이, 11-12번 흉추 사이, 13번 흉추-1번 요추 사이)에서 측정한 등지방두께와 도체장(CL)의 수준은 유전자형애 따른 유의적인 차이를 나타내었지만(p<0.05), 육색(MC), 등심단면적(EMA)과 근내지방도(MARB)은 유의적인 차이를 나타내지 않았다(p>0.05). IDH3B 동형접합자 BB를 보유한 F₂ 돼지들은 도체중이 더 무겁고(80.790±0.725 kg), 도체장은 더 짧은(101.875±0.336 cm) 양상을 보였다(p<0.05). 또한, IDH3B 유전자형 BB인 개체들은 IDH3B AA나 AB 유전자형에 비해 4-5번 흉추 사이, 11-12번 흉추 사이에서 측정된 등지방두께도 더 두꺼운 수준을 나타내었다(p<0.05). 이상의 결과들은 IDH3B의 유전적 다양성이 제주흑돼지와 랜드레이스와 관련된 교배육종 체계의 산육능력 향상을 위한 유전적 분자 표지인자로 활용될 수 있음을 나타내었다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제52권1호
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• pp.1-7
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• 2009

후대교배종 CM 벼의 정성 PCR 검정방법을 개발하기 위하여, 벼의 내재유전자로써 OsCs-J(rice cytochrome c gene)을 선발하여 OsCytC-5'/3'의 primer쌍을 제작하고, 벼를 포함한 서로 다른 8개 작물에 대하여 PCR을 수행한 결과 벼에 특이적으로 증폭되는 111 bp의 반응 산물을 확인하였다. 국내 개발된 LS28$\times$CryIAc1 GM 벼의 검정 분석으로 정성 PCR 반응을 수행하였다. 정성 PCR을 위하여 GM 벼에 도입된 T-DNA 및 게놈상의 도입유전자 삽입부위의 인접서열을 바탕으로 구조 및 계통 특이적인 검정 primer 쌍을 제작하였다. ActCk-5'/3' primer 쌍을 이용하여 LS28의 T-DNA 내의 actin 프로모터와 OsCK1 유전자 사이를 증폭시켜 306 bp의 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었으며, 또한 계통특이 primer 쌍인 CryIAc1 GM 벼유래의 CrLB-5'/3' 및 LS28 GM 벼 유래의 CKRB-5'/3'를 이용한 PCR 반응으로 각각 142 bp와 91 bp의 도입유전자의 인접서열 부위의 특이적인 증폭 산물을 확인할 수 있었다. 계통 특이적 검정을 위한 이들 개발 primer 쌍들은 event 계통과 대조적으로 non-GM 벼와 다양한 작물에 대하여 어떠한 특이적인 PCR 증폭 산물을 형성하지 않았다. 따라서 본 연구에서 계통특이 primer를 이용하여 후대교배종 GM 벼 계통, L528$\times$CryIAc1을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였고, 제시된 방법이 GM 벼의 실용화를 위한 위해성평가의 검정방법 자료로 제공될 수 있음을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제41권2호
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• pp.99-104
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• 2005

유전자 lacZYA가 aces 유전자의 프로모터 하단에 연계된 $(P_{aceB}-lacZYA)$ 리포터 플라스미드를 함유하는 Escherichia coli를 이용하여 glyoxylate bypass를 매개하는 유전자중하나인 aceB의 발현을 조절하는 것으로 여겨지는 Corynebacterium glutamicum클론들을 색판독에 의해 분리하였다. 이 중 한 개의 클론을 선택하여 분석할 결과 이 클론을 함유한 E. coli는 리포터 플라스미드에서 발현되는 $\beta-galactosidase$의 활성 이 약 $40\%$ 감소하였고 이는 클론에서 발현되는 단백질이 aceB프로로터에 작용함에 기인한 것으로 판단되었다. 서열분석결과 ORF1과 ORF2의 두 개의 인접한 ORF가 발견되었고 이중 ORF2가 reporter plasmid의 $\beta-galactosidase$의 활성 감소에 직접적으로 기여함을 알 수 있었다. ORF1은 206아미노산으로 구성된 23,218 Dalton의 단백질을 발현하는 것으로 여겨졌고, 유사성 분석결과 ECF-type에 해당되는 RNA polymerase의 sigma factor를 암호화하는 것으로 보여 sigH로 명명하였다. 유전자 sigH의 기능을 밝히기 위해 gene disruption technique을 이용하여 sigH 유전자가 기능을 하지 못하는 돌연변이 균을 제작하였으며 이 균주는 야생형에 비해 성장속도가 저하됨을 관찰하였다. 또한 변이균은 oxidative stress를유발하는 pumbagin둥에 대해서도 민감성을 나타내었다. 이들 결과는, 유사성 분석결과에서도 볼 수 있듯이 sigH유전자가 세포성장과정 중 처하게 되는 각종 stress중 특히 oxidative stress에 대한 대응과 관련되어 발현될 수 있음을 암시한다.상관관계는 공간적인 범위가 10$\times$10km 이하인 경우에 높게 나타났다. 하지만 공간범위가 그 이상이 될 경우에는 그 내부에서 나타나는 다양성으로 인해 통계적인 상관성이 현격하게 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 지역 및 국가 단위의 환경변화모델에서 모델의 공간적인 구성범위가 일정한 수준을 넘으면, 그 내부에서 발생하고 있는 다양성이 급격하게 증가하여 지표피복변화의 원인과 결과를 정확하게 파악하기 힘들게 된다는 것을 의미한다. 10$\times$10km의 공간적인 범위는 농업생산이 위주가 되는 사바나 지역에서는 주로 개별 마을이 차지하고 있는 공간적인 범위와 대체적으로 일치한다. 따라서 사바나 지역에서 나타나는 지표피복변화의 다양성을 고려하면서 보다 정확하게 모형화하기 위해서는 마을단위에서 나타나는 지표피복변화과정이 최소의 모델단위가 되어야 함을 시사한다. 아니라 다른 방법으로 영향을 미치고 있다는 것을 알 수 있었다., 계절별로는 여름철에 강수가 집중됨으로서 습성강하물 침착량이 총량적으로 증가하였으며, 그 값은 $SO_4^{2-}\;2.118g/m^2/season,\;NO_3^-\;1.509g/m^2/season,\;Cl^-\;2.185g/m^2/season,\;NH_4\;^+\;1.096g/m^2/season$로. 나타났다. 계절별 잎의 평균 pH의 변화는 봄 pH $5.9\pm0.5$, 여름 pH $5.5\pm0.4$, 가을 pH $5.1\pm0.3$을 나타내었고, 엽중 수용성 황함량의 계절별 평균값은 봄 $0.012\pm0.004\%$, 여름 $0.012\pm0.002\%$, 가을 $0.020\pm0.007\%$ 수준을 보이고 있다. 수피 내 함유되어

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제22권2호
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• pp.164-173
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• 2000

The p16 protein is a cyclin dependent kinase inhibitor that inhibits cell cycle progression from $G_1$ phase to S phase in cell cycle. Many p16 gene mutations have been noted in many cancer-cell lines and in some primary cancers, and alterations of p16 gene function by DNA methylation have been noticed in various kinds of cancer tissues and cell-lines. There have been a large body of literature has accumulated indicating that abnormal patterns of DNA methylation (both hypomethylation and hypermethylation) occur in a wide variety of human neoplasma and that these aberrations of DNA methylation may play an important epigenetic role in the development and progression of neoplasia. DNA methylation is a part of the inheritable epigenetic system that influences expression or silencing of genes necessary for normal differentiation and proliferation. Gene activity may be silenced by methylation of up steream regulatory regions. Reactivation is associated with demethylation. Although evidence or a high incidence of p16 alterations in a variety of cell lines and primary tumors has been reported, that has been contested by other investigators. The precise mechanisms by which abnormal methylation might contribute to carcinogenesis are still not fully elucidated, but conceivably could involve the modulation of oncogene and other important regulatory gene expression, in addition to creating areas of genetic instability, thus predisposing to mutational events causing neoplasia. There have been many variable results of studies of head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC). This investigation was studied on 13 primary HNSCC for p16 gene status by protein expression in immunohistochemistry, and DNA genetic/epigenetic analyzed to determine the incidence, the mechanisms, and the potential biological significance of its Inactivation. As methylation detection method of p16 gene, the methylation specific PCR(MSP) is sensitive and specific for methylation of any block of CpG sites in a CpG islands using bisulfite-modified DNA. The genomic DNA is modified by treatment with sodium bisulfate, which converts all unmethylated cytosines to uracil(thymidine). The primers designed for MSP were chosen for regions containing frequent cytosines (to distinguish unmodified from modified DNA), and CpG pairs near the 5' end of the primers (to provide maximal discrimination in the PCR between methylated and unmethylated DNA). The two strands of DNA are no longer complementary after bisulfite treatment, primers can be designed for either modified strand. In this study, 13 paraffin embedded block tissues were used, so the fragment of DNA to be amplified was intentionally small, to allow the assessment of methylation pattern in a limited region and to facilitate the application of this technique to samlples. In this 13 primary HNSCC tissues, there was no methylation of p16 promoter gene (detected by MSP and automatic sequencing). The p16 protein-specific immunohistochemical staining was performed on 13 paraffin embedded primary HNSCC tissue samples. Twelve cases among the 13 showed altered expression of p16 proteins (negative expression). In this study, The author suggested that low expression of p16 protein may play an important role in human HNSCC, and this study suggested that many kinds of genetic mechanisms including DNA methylation may play the role in carcinogenesis.

• Journal of Genetic Medicine
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• 제5권1호
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• pp.15-20
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• 2008

목 적 : 듀시엔/베커형 근이영양증(Duchenne and Becker type muscular dystrophy; DMD/BMD)은 남아에게 나타나는 일반적인 X 염색체 연관 유전성 근육 질환으로 DMD(dystrophin) 유전자의 돌연변이로 인해 생긴다. 그 중 큰 exon 결실이 전체 DMD 환자의 약 50-60%에서 발견된다. 이 유전자의 돌연변이를 찾기 위해 여러 방법들이 사용되고 있지만 결실 돌연변이를 찾아내기 위한 가장 일반적인 방법으로 복합적 중합효소연쇄반응을 이용하고 있다. 하지만 이 방법의 단점은 하나의 시험관 안에 복합적인 시발체가 존재하여 정확한 반응 조건을 찾기 힘들 뿐 아니라 시발체 상호간의 간섭으로 중합효소 연쇄반응의 비특이적 생성물을 빈번하게 일으켜 잘못된 음성 또는 양성 결과를 가져올 수 있다. 이런 문제를 보완하고자 Dual Primer Oligonucleotide(DPO) 방법을 도입하였다. DPO는 polydeoxyinosine 연결에 의해 두 영역으로 분리된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)로 표적 DNA 염기서열과의 교잡반응에 높은 특이적 반응을 보여 복합 중합효소 연쇄반응의 정확도를 높여준다. 본 연구에서는 3 그룹을 대상군으로 DMD 유전자의 결실돌연변이 검색을 위한 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법의 특이성과 민감성을 알아보고자 하였다. 방 법 : 50명의 건강한 남자 대조군, 50명의 결실 돌연변이를 갖고 있는 양성반응 환자그룹 그리고 20명의 결실 돌연변이를 가지고 있지 않은 음성반응 환자 그룹으로 구성된 3 그룹을 대상으로 DPO-복합 중합효소 연쇄반응법을 이용하여 실험하였다. 이들 120명의 실험군 모두 PMter영역과 exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43-48, 50-52, 60을 포함하는 18개의 exon에서의 결실의 여부와 결실 범위를 확인하였다. 결 과 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 결실 여부를 발견하는데 100%의 특이성과 민감성을 보였다. 하지만 결실 범위의 결정에는 97.1%의 민감성과 특이성을 보였다. 결 론 : DPO-복합 중합효소 연쇄반응법은 기존의 복합 중합효소 연쇄반응법 보다 높은 분석 확실성을 보일뿐 아니라 빠르고 저렴한 비용으로 쉽게 할 수 있기 때문에 듀시엔/베커형 근이영양증 환자의 DMD 유전자의 결실돌연변이 여부를 확인하는데 유용한 방법이다.