후 컬럼 동위원소 희석법(PCID, post column isotope dilution)을 HPLC-ICP/MS (high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma/mass spectrometry)에 적용한 정량법에서 내부 표준물을 동시에 사용하여 정확도와 정밀도를 개선하였다. 전통적인 여러 정량법과 후 컬럼 동위원소 희석법을 비교하여 볼 때에 PCID의 경우에 컬럼내에서 발생하는 오차가 가장 큰 요인으로 작용하였음을 알 수 있었다. PCID에서 내부 표준물을 사용하여 컬럼내에서의 손실에 대한 오차를 효과적으로 보정하고 정확도와 정밀도를 개선할 수 있었다. 셀레늄 화학종인 SeMet을 시료로 사용하고 내부 표준물로 MeSecys 또는 $Se^{4+}$를 이용한 결과, 사용하지 않은 경우와 비교하면 상대오차는 각 각 31%와 13%에서 모두 1% 대로 낮아져 정확도가 크게 개선되었으며, 상대 표준편차는 5.1%와 6.9%에서 각각 1.5%와 0.2%로 정밀도 또한 크게 개선되었다. PCID에서 내부 표준물을 사용하였을 때의 정량분석법의 장점을 다른 분석법과 비교 토의하였다.
후 컬럼 동위원소 희석법의 불확도를 HPLC-ICP/MS에서 Selenomethionine을 분석할 경우에 대하여 간단히 연구하였다. 주요하다고 생각한 오차의 원인으로 셀레늄 동위원소 용액의 농도와 흐름속도, 스파이크 용액과 시료 용액에서의 셀레늄 원자량, 그리고 스파이크된 시료용액에서 측정된 동위원소의 비를 선택하였다. 각 요인에 따른 불확도를 구하고 전체 농도의 불확도에 미치는 요인을 계산한 결과, 각각에 대하여 54.4%와 0.61%, 0.0072%와 0.018%, 그리고 45.0%를 얻었다. 가장 큰 요인은 스파이크 동위원소 용액의 농도이며 두 번째는 스파이크가 첨가된 시료용액에서의 동위원소비이었다. 스파이크 용액의 질량흐름속도와 원자량의 불활도는 크게 영향을 끼치지 못하였다. 계산된 전체불확도는 $126.30ng{\cdot}g^{-1}$ SeMet 표준용액에 대하여 $1.46ng{\cdot}g^{-1}$으로서 실험결과는 $127.09ng{\cdot}g^{-1}$을 얻었고 상대불확도는 1.20%이었다.
Various separation modes in HPLC, such as anion exchange (AE), reversed-phase (RP), and affinity (AF) chromatography were examined for the separation of selenium species in human blood serum and urine. While RP- and AE-HPLC were mainly used for the separation of small molecular selenium species, double column AF-HPLC achieved the separation of selenoproteins in blood serum efficiently. Further, the effluent of AF-HPLC was enzymatically hydrolyzed and then analyzed with RP HPLC for selenoamino acid study. The versatility of the hybrid technique makes the in-depth study of selenium species possible. For quantification, post column isotope dilution (ID) with $^{78}Se$ spike was performed. ORC ICP/MS (octapole reaction cell inductively coupled plasma/mass spectrometry) was used with 4 mL $min^{-1}$ Hydrogen as reaction gas. In urine sample, inorganic selenium and SeCys were identified. In blood serum, selenoproteins GPx, SelP and SeAlb were detected and quantified. The concentration for GPx, SelP and SeAlb was $22.8{\pm}3.4\;ng\;g^{-1}$, $45.2{\pm}1.7\;ng\;g^{-1}$, and $16.1{\pm}2.2\;ng\;g^{-1}$, respectively when $^{80}Se/^{78}Se$ was used. The sum of these selenoproteins ($84.1{\pm}4.4\;ng\;g^{-1}$) agrees well with the total selenium concentration measured with the ID method of $87.0{\pm}3.0\;ng\;g^{-1}$. Enzymatic hydrolysis of each selenium proteins revealed that SeCys is the major amino acid for all three proteins and SeMet is contained in SeAlb only.
셀레늄은 다양한 화학종으로 존재하며 그 농도와 형태에 따라 활성도나 생물학적 이용도가 달라지므로 식품에 대한 셀레늄 화학종의 정확한 분리 및 정량이 필요하다. 본 연구에서는 역상 (RP; reversed phase) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC; high performance liquid chromatography)와 유도결합 플라즈마 (ICP; inductively coupled plasma) 질량분석법 (MS; mass spectrometry)을 사용하여 해산물 시료 중 셀레늄 화학종을 분리 검출 한 뒤에 후 컬럼 동위원소희석법 (post column isotope dilution)으로 정확히 정량 하였다. 시료 중 $^{80}Se$의 간섭요인인 $^{79}Br$을 제거하기 위해 고체상 추출법을 사용하여 대부분의 $^{79}Br$을 제거하였고 남아있는 $^{79}Br$은 수학적 보정식을 이용하여 보정해주었다. CRM (certified reference material) DOLT-4를 사용하여 셀레늄의 총량을 분석한 결과는 인증치와 잘 일치하였지만 각 화학종에 대한 정보는 비교할 수 없었다. 한국인 식탁에 오르는 대표적인 해산물 시료인 갈치, 삼치, 오징어, 등을 분석한 결과, 주된 셀레늄 화학종은 SeCys (selenocysteine)와 SeMet (selenomethionine)이었으며 각각은 0-661.6 mg/kg and 137.3-462.7 mg/kg의 농도로 존재함 을 알 수 있었다.
본 연구에서는 음이온 고체상 추출법 (AE SPE; anion exchange solid phase extraction)을 사용하여 간섭요인을 제거한 후, 친화 크로마토그래피 AF HPLC; affinity high performance liquid chromatography)와 유도결합 플라스마 질량분석법 (ICP/MS; inductively coupled plasma/mass spectrometry)을 사용하여 한국인의 혈청에서의 셀레노 단백질을 분리하고 정량하였다. 먼저 동위원소 희석법으로 셀레늄 총량을 분석한 결과, 건강한 한국 사람의 혈청내 평균농도는 $94.3{\pm}2.3ngg^{-1}$ 이었다. AE SPE와 AF 컬럼을 online으로 연결하여 셀레노단백질인 glutathione peroxidase (GPx), selenoprotein P (SelP), selenoalbumin (SeAlb)을 분리하고, 후 컬럼 동위원소 희석법 (PC ID; post column isotope dilution)으로 정량하였다. 혈청 인증표준물인 BCR-637을 분석한 결과 전체 셀레노 단백질의 합은 $85.4{\pm}3.4ngg^{-1}$으로 문헌값인 $81{\pm}7ngg^{-1}$과 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 20 명의 건강한 한국인의 혈청에서 얻은 셀레노 단백질 GPx, SelP 및 SeAlb 의 농도는 각각 $12.1{\pm}1.4ngg^{-1}$, $57.2{\pm}2.0ngg^{-1}$, 그리고 $20.0{\pm}1.9ngg^{-1}$ 이었으며 이들의 합인 $89.3ngg^{-1}$은 셀레늄의 총량값인 $94.3ngg^{-1}$과 거의 같은 값으로 혈청에서의 셀레늄은 주로 셀레노 단백질로 구성되어 있음을 알았다. 이 중 GPx의 농도는 간섭을 제거하기 전인 $25.0ngg^{-1}$에 비해 50% 이상 크게 감소하였는데 이로서 간섭은 주로 GPx에 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. AE SPE는 간섭요인인 Cl과 Br을 제거 하는데 매우 효과적임을 보여주었다.
셀레늄 강화 사료를 먹인 모돈에 대하여 혈청에서의 셀레늄 화학종들 즉, 무기셀레늄, 셀레노아미노산 및 셀레노단백질들을 음이온 교환과 친화 크로마토 그라피를 ICP/MS에 연결사용하여 분석하였다. 무기 셀레늄(Se4+와 Se6+)과 셀레노 아미노산들은 PRP X-100 음이온 교환 컬럼을 사용하였고 셀레노 단백질들의 경우에는 HEP 컬럼을 사용하여 SelP을 GPx+SeAlb로 부터 분리하였다. 정량분석은 후 컬럼 동위원소 희석법을 사용하여 이 들의 농도를 결정하였다. 모돈 실험군을 3 그룹으로 나누고 셀레늄이 강화된 사료(유기셀레늄 0.3 mg/kg, 0.6 mg/kg 및 무기셀레늄 0.6 mg/kg)를 4주 동안 먹였을 때 셀레늄 화학종들의 변화 및 사료와의 상관관계를 알아보았다. 셀레노 아미노산의 경우, 실험군들은 무기셀레늄 강화사료를 제외하고 대조군에 비하여 높은 농도를 보여주었다. 유기셀레늄 강화사료에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 셀레노 단백질의 경우는 실험군 모두가 대조군에 비하여 증가를 보여주었는데 특히 SelP가 다른 단백질에 비하여 1.5 배 정도 더 크게 증가한 것으로 나타났다.
본 연구에서는 한국인을 대상으로 하여 혈중 셀레노단백질의 함량과 위암과의 상관관계를 연구하였다. 혈청 속에서의 셀레노단백질의 함량을 종별로 분석하여, 각 단백질의 함량과 위암과의 상관관계를 알아보고 셀레늄의 위암에 대한 생체지표로서의 가능성을 알아보고자 하였다. SPE를 사용하여 방해 이온들을 제거한 뒤 후컬럼 동위원소법으로 정량한 기존의 복잡한 방법과 달리 SPE를 사용하지 않고 m/z 78을 모니터링하고 검정곡선법으로 정량하였다. 표준인증물질인 CRM BCR-637을 사용하여 정확도를 검증한 결과 72.20±3.35 ng·g−1로서 기준값인 81±7 ng·g−1에 만족할 만한 결과를 얻었다. 먼저 통제군인 순환기 질환 환자 혈청 속의 셀레노단백질의 총농도를 조사해본 결과 105.70±21.20 ng·g−1으로서 정상인의 값과 차이가 없었다. 각 종별 농도를 보면 GPx와 SelP, 그리고 SeAlb이 각 각 26.12±7.84, 65.15±14.50, 14.43±6.99 ng·g−1이며 분포는 24.7%, 61.6%, 및 13.7% 이었다. 한국인의 위암 환자의 혈청을 분석한 결과, GPx와 SelP, 그리고 SeAlb의 농도는 각각 15.41±9.01, 50.83±17.9, 그리고 9.87±5.21 ng·g−1이며 총 농도는 76.11±28.12 ng·g−1으로 대조군에 비하여 총량과 각 종들도 모두 큰 감소를 보였다. 감소폭은 GPx는 41.0%, SelP 22.0%, SeAlb 31.6% 이었다. 하지만 종별 분포는 유의미한 차이를 보이지 않았고 따라서 위암 환자의 경우 셀레노단백의 총량을 분석하거나 또는 그 중 하나의 단백질을 사용하여도 암을 진단하는 보조적인 지표가 될 수 있을 것으로 생각되었다. 또한 나이별에 따른 분석을 보면 노년인 50대 부터 70대에서는 실험군과 대조군이 확실한 차이를 보이나 30대와 40대에서는 별 차이를 보이지 않고 있으므로 성별, 나이별에 따른 조사가 더 필요할 것으로 보인다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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