제주지역 양식넙치의 주요 세균성 질병의 일종인 연쇄구균증 발병동향과 특성을 분석하였다. 제주지역 양식넙치의 연쇄구균증은 연중 발생하는 양상을 보였으나 상대적으로 고수온기에 발생율이 높았으며, 30cm 이상의 개체에서 주로 관찰되었다. 2003년 6월부터 2005년 5월 사이에 분리된 연쇄구균 균주를 multiplex PCR assay 기법을 이용하여 종 조성을 분리한 결과 Streptococcus iniae와 S. parauberis로 동정되었으며 그 비율은 각각 46%와 54%이었다. S. iniae는 상대적으로 9월과 10월에 높은 분리율을 나타내었으나 S. parauberissms 3월과 4월에 분리율이 높게 나타났다. S. iniae와 S. parauberis 감염개체의 병리학적 중상은 일부분 유사하였으나 S. iniae 분리개체는 복부팽만, 탈장, 복수저류증상이 주로 관찰되는 반면, S. parauberis 분리개체는 체색흑화, 무안측 발적 중상이 두드러지게 관찰되었다. 이 두 종의 병원체 모두 ampicillin과 amoxicillin에 감수성이 높았으며, S. iniae 균주들은 S. parauberis 균주들보다 상대적으로 doxycycline, erythromycin, oxytetracycline에 감수성이 높았다.
천연 항균물질의 연구는 대부분 식품소재, 특히 약용식물을 대상으로 하여 많은 연구가 진행되어 왔다. 그러나 식품소재의 경우 대량의 추출물 등을 제조하기 위해 많은 양의 재료가 필요하며, 이로 인한 비용 문제가 발생하게 된다. 미생물은 적절한 환경 하에서 대량 배양이 용이하기 때문에 천연항생제로 이용하기 위해 지속적인 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 식물병 억제에 효과가 있는 식물근권미생물을 이용하여 어류질병세균 4종을 대상으로 항균활성을 확인하였다. 이 중 항균활성을 나타낸 균 3종을 선발하여 배양액, 상층액, 균체 현탁액으로 나누어 어느 부위에서 항균효과를 나타내는지 탐색하고, 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 균을 동정하였다. 12종의 식물근권세균 중 BRH433-2, THJ609-3, TRH415-2 3종에서 항균활성이 나타나는 것을 확인하였다. 세 균주의 배양액, 상층액, 균체 현탁액 중에서는 균체 현탁액이 가장 강한 항균활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 세 균주의 16S rDNA 염기서열 분석 결과, BRH433-2는 Burkholderia gladioli와 99.5%, B. plantarii 98.9%, B. ubonensis 98.5%, B. pyrrocinia 98.3%, B. glumae 98%로 나타났다. THJ609-3은 Pseudomonas baetica와 97.7%, P. moorei와 P. plecoglossicida에 대해서는 각각 97.6%, 97.5%의 상동성이, TRH415-2는 P. koreensis, P. baetica와 98.4%, P. moraviensis 98.3%의 염기서열 유사도를 나타났다. 따라서 3종의 식물근권세균은 충분한 안정성 및 안전성 실험을 실행한 후, 양식산업에 적용하여 항생제 대체 물질로서의 이용가치가 있다고 생각된다.
본 연구는 lincomycin (LM)의 근육투여에 따른 저수온(13℃)에서의 잔류 특성 및 넙치에서 병원성 세균으로 발견되는 그람음성 세균에서의 시험관 내 in vitro 약효를 평가하기 위하여 수행하였다. LM을 10, 20 및 40 mg/kg의 용량으로 단회 투여하였을 때, 근육내 농도가 잔류허용기준인 0.1 mg/kg 이하로 감소하는 기간은 각각 32일, 33일 및 55일로 평가되었다. 또한, 현장 분리 균주 그람음성 세균인 Edwardsiella piscida 및 Vibrio harveyi에 대하여 LM의 minimal inhibitory concentration (MIC)로 평가된 in vitro 약효는 각각 >256 ㎍/mL 및 32 ㎍/mL을 나타냈다. 연구 결과, 넙치 양식장에서 사용되는 LM의 임상용량인 10 mg/kg을 고려하였을 때의 휴약기간을 30일 이상으로 설정하면 합리적일 것으로 판단된다. 또한 LM이 넙치 연쇄상구균증 치료 목적으로 투여될 때 그 동시에 감염된 그람음성 세균에는 약효가 발휘되지 않을 것으로 추정한다.
본 연구는 우리 나라의 해산 양식어류 양식장에서 발생하는 연쇄구균증 원인균의 종 조성과 미생물학적 연쇄구균증 원인균의 종 조성과 미생물학적 특성을 밝히고자 하였다. 안구 백탁, 안구 출혈, 아가미뚜껑 출혈 및 복부 팽만 등의 증상이 관찰되는 해산 양식어류에서 분리된 연쇄상구균의 여러 균주들을 Lactococcus garvieae와 생리학적, 생화학적, 혈청학적 특성을 비교하였다. 또한 polymerase chain reaction(PCR)assay로 분리 균주들과 L.garvieae의 연관성을 조사하였으며 연쇄구균증 원인균들의 분포 특성을 조사하였다. 연쇄구균증을 나타내는 3종의 해산 양식어류로부터 연쇄상구균 35균주를 분리하였으며, 이 균주들의 생리, 생화학적 특성을 L.garvieae와 비교해 본 결과 15 균주가 L.garvieae에 속하는 것을 알 수 있었다. 분리균주를 참조균주인 ATCC49156토끼 향혈청으로 슬라이드 응집 시험한 결과 L.garvieae $KG^+$ type과 응집하는 균주가 7균주로 관찰되었다. 또한 L.garvieae의 특이 primers, pLG-1(5`-CATAACAATGAGATCGC-'3)와 pLG-2(5'-GCACCCTCGCGGGTTG-3')를 사용한 16S rRNA의 PCR 시험 결과 분리균주 중 21 균주가 예상 band를 형성하여 L.garvieae로 판단하였다. 이상의 결과에 따르면 35종의 분리균주 중 L.garvieae가 21 균주, Enterococcus sp.rk 5 균주, Streptococcus sp.가 9종으로 조사된 지역에서 연쇄구균에 의한 질병 발생은 L.garvieae가 우점을 차지함을 알 수 있었다.
세균성 어류질병의 치료 및 예방을 위하여 어류와 인체에 안전한 수산용 probiotic의 개발이 요구되고 있다. 본 연구에서는 남해안 일대에서 양식되고 있는 참굴 (Crassostrea gigas), 바지락 (Ruditapes philippinarum), 피조개 (Scapharca broughtonii), 새조개 (Fulvia mutica)의 가식 부위로부터 17균주의 candidate probiotic bacteria (CPB)를 분리하였다. 나아가 다양한 연쇄상구균 (Lactococcus garvieae, L. piscium, Streptococcus sp., S. iniae, and S. parauberis)에 대하여 강한 생장 억제력을 보이는 균주(CPB-St)를 선별하여 어류의 연쇄구균증 관리를 위한 probiotic 균주로서의 개발 가능성을 알아보았다. CPB-St 균주를 double layer test를 통하여 다양한 연쇄상구균들에 대한 생장 억제 정도를 알아보았으며, 혼합 배양에서의 Streptococcus sp.에 대한 생장 억제 능력을 확인하였고, CPB-St의 어류에 대한 안전성 및 장내 생존 유무를 평가하였다. CPB-St는 대부분의 연쇄상구균에 대하여 18~26 mm의 생장 억제대를 형성함으로써 높은 생장 억제 능력을 보였다. CPB-St와의 혼합 배양에서 Streptococcus sp.는 6시간째부터 생장 억제 현상이 관찰되기 시작하여 12시간 전후로 8~55배 정도의 감소를 나타내었다. CPB-St의 어류에 대한 병원성 유 무를 알아본 결과, 2주일 동안 CPB-St로 인한 어류 폐사는 관찰되지 않았다. CPB-St의 1회 강제 경구 투여 후, 위와 장에서 CPB-St의 생존을 확인한 결과 투여 24시간 후에는 CPB-St가 모두 배출되는 것으로 나타났다. CPB-St를 probiotic bacteria로 개발하기 위해서는 어류의 장내 정착 가능성과 먹이를 통한 효과의 정확한 검증이 추후 이루어져야 할 것이다.
Scuticociliatosis caused by Miamiensis avidus is a very important parasitic disease in olive flounder farming industry. The aim of this study was to determine effect of combined treatment with blue LED (light-emitting diode) illumination and formalin on olive flounder (Paralichthys olivaceus) infected with M. avidus. Different intensity of 405 nm LED (20, 40, and 60 μmol·m-2·s-1) was illuminated on 2.2×104 cells/well of M. avidus in a 24 well microplate for 24 h. Also, 2.4×104 cells/well of M. avidus were exposed to varying combinations of 60 μmol·m-2·s-1 of 405 nm LED and serial 10-fold dilutions of formalin (from 10 to 100 ppm) for 15, 30, 45, and 60 min. Surviving M. avidus were counted using a hemocytometer. For in vivo test, flounder acclimatized at 11-12 practical salinity unit (psu) were challenged with 2×106 cells/ml of M. avidus by immersion method for 1 h. Then, fish were moved and divided into four groups; "F" group, treated with formalin at 50 ppm; "L" group, treated with 60 μmol·m-2·s-1 of 405 nm LED; "C" group, treated with combination of the two methods; and the control group. After treatment for 30 min, fish were transferred to new tanks (salinity = 11-12 psu) and observed for 3 weeks. As a result, illumination of 405 nm LED at 60 μmol·m-2·s-1 killed 100% of M. avidus after 12 h, while 67% and 90% of the scuticociliate died at 20 and 40 μmol·m-2·s-1, respectively, after 24 h exposure. One hundred percent of M. avidus was killed at 90, 80, 80 and 70 ppm after exposure to formalin for 15, 30, 45 and 60 min, respectively. However, combined method (e.g., 60 μmol·m-2·s-1 of 405 nm-LED plus 50 ppm formalin) killed the parasite within 30 min. From in vivo test, similarly, survival rates of fish challenged with M. avidus were 100%, 43%, 29% and 0% in the C, F, L, and control groups, respectively. Results obtained in this study demonstrates that the combined treatment method has clear synergistic effect on scuticociliatosis in fish.
우리 연구팀은 넙치를 대상으로 사료 내 발효마늘분말(fermented garlic powder, FGP)의 첨가에 의한 비특이적 면역반응과 어병세균(V. anguillarum, S. iniae, E. tarda)에 대한 질병 저항성에 대해 처음으로 보고한다. 동일한 단백질 함량(45%)과 칼로리(17.1 MJ/kg)를 갖은 4개의 실험사료는 발효마늘분말이 0%, 0.5%, 1% 및 2% (G-0, G-0.5, G-1 및 G-2)가 포함되도록 조성되었다. 실험은 3반복구로 수조 당 30마리의 어류를 대상으로 유수식 시스템에서 수행되었다. 5주간의 성장실험 종료 후, 각 수조에서 건강한 어류를 선별하여 어류의 항병력을 평가하기 위해 3가지 박테리아 부유액(1 ml)을 복강에 주사하였다. 5주간의 성장실험기간 동안에 성장률, 일간성장률, 사료전환효율, 단백질전환효율 및 생존율에서는 실험사료에 의한 유의적인 차이가 없었다. 그러나 사료섭취율은 발효마늘분말이 2% 첨가된 그룹에서 대조구와 비교하여 유의적으로 낮았다. 헤모글로빈, 헤마토크릿, 대식세포 활성 및 라이소자임 활성에서는 사료 내 발효마늘분말 함량이 증가함에 따라 유의적으로 증가하였다. 발효마늘분말 0.5% 첨가구의 혈장 중성지질은 대조구보다 유의적으로 낮았다. 누적사망률은 E. tarda의 경우를 제외한 모든 공격실험에서 발효마늘분말이 포함된 사료를 섭취한 어류가 대조구와 비교하여 유의적으로 낮았다. 이번 연구의 결과를 볼 때, 사료 내 발효마늘분말의 첨가는 넙치에 있어서 V. anguillarum과 S. iniae에 대한 항병력 및 비특이적 면역반응을 향상시킨 것으로 사료된다.
본 연구는 자연산 어류와 양식어류 사이의 병원체 존재에 대한 상관관계구명을 위한 기초 연구의 일환으로서, 우리나라의 자연산과 양식산 넙치, 참돔, 감성돔, 조피볼락의 병원체 감염 현황을 조사하고 그 결과를 비교하였다. 기생충성 질병의 조사 결과, 자연산 넙치와 참돔에서 가장 높게 검출 된 Anisakis sp. (각 58.6%, 41.7%) 는 양식 넙치와 참돔에서 검출되지 않아 자연산과 양식산 어류에서 아주 큰 차이를 보였다. 이는 배합 사료를 공급하는 양식산 어류에 비해, 자연산 어류는 아니사키스에 오염된 갑각류나 작은 물고기 등을 먹이원으로 섭취하기 때문인 것으로 생각되었다. 세균성 질병의 조사 결과, 자연산 어류에 비해 양식산 어류에서 세균이 높은 비율로 검출되었으며, 양식 넙치에서 Vibrio sp.가 18%로 높은 비율로 검출되었다. 비브리오병은 주로 스트레스 등에 의한 2차적 세균성 질병으로 알려져 있는 것으로부터, 양식 넙치가 다른 병원체의 감염, 이동이나 선별, 빈번한 항생제 사용 등 스트레스 환경에 노출된 것으로 판단되었다. 바이러스의 조사 결과, 자연산 어류와 양식어에서 다른 양상을 보였으며, 양식 넙치에서 LCDV (3.9%) 가 가장 높은 검출률을 나타내었다. 본 연구의 결과로부터 자연산과 양식산에서 동시에 검출되는 병원체도 있었으나, 동일 수역에 존재하는 같은 어종이라도, 먹이나 환경에 따라 분리되는 병원체가 다른 것을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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