Endosulfan is a chlorinated pesticide; its persistence in the environment and toxic effects on biota are demanding its removal. This study aims at improving the tolerance of the previously isolated fungus Aspergillus niger (A. niger) ARIFCC 1053 to endosulfan. Released chloride, dehalogenase activity, and released proteins were estimated along with analysis of endosulfan degradation and pathway identification. The culture could tolerate 1,000 mg/ml of technical grade endosulfan. Complete disappearance of endosulfan was seen after 168 h of incubation. The degradation study could easily be correlated with increase in released chlorides, dehalogenase activity and protein released. Comparative infrared spectral analysis suggested that the molecule of endosulfan was degraded efficiently by A. niger ARIFCC 1053. Obtained mass ion values by GC-MS suggested a hypothetical pathway during endosulfan degradation by A. niger ARIFCC 1053. All these results provide a basis for the development of bioremediation strategies to remediate the pollutant under study in the environment.
코발트 정광으로부터 코발트와 구리의 회수를 위한 기초 연구로 Aspergillus균주를 사용하여 당밀 배지에서 Co, Cu, Fe, Mg, Al 등의 미생물 침출 거동을 조사하였다. 실험의 주요 변수로는 균주 종류 및 당밀의 당도, 고액농도(pulp density), 반응시간 등의 영향에 대해 고찰하였다. 실험결과 당밀의 농도가 증가할수록 코발트 및 구리의 침출율이 증가하는 경향을 보였으며 적정 당도는 4%이었다. 한편, Aspergillus niger KCTC 6985의 경우 당도 4%, 고액농도가 10 g/L인 조건에서 21일 경과 후 코발트는 최대 90 %, 구리의 경우는 최대 70%의 침출율을 나타내었고, Aspergillus niger KCTC 6144의 경우는 당도 4%, 고액농도가 5 g/L에서 코발트 및 구리가 각각 90%의 최대 침출율을 나타내었다.
1. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe 4683, Aspergillus niger의 세 종류의 균류를 2% 펙틴이 함유된 액체 배지를 사용하여 3$0^{\circ}C$에서 진탕 배양하여 pectin Transeliminase (PTE)를 생성 시켰다. 2. Asp. niger의 PTE의 생성은 두 종류의 효모균보다 월등히 높았다. 이들 효소의 환원력을 측정한 결과 Asp. niger의 PTE는 효모의 그것에 비하여 대단히 높았다. 즉 환원력은 PTE 활성에 비례함을 알 수 있었다. 3. PTE 효소에 의한 펙틴의 분해 산물은 4,5-unsaturate galacturonic acid임이 확인되었다. 4. 세가지 균류의 효소 환성의 최적 PH는 6.0이었고 최적 온도는 $50^{\circ}C$이었으며 온도에 의한 효소의 불활성도는 1$0^{\circ}C$에서 $50^{\circ}C$까지는 거의 없었으나 6$0^{\circ}C$ 이상에서는 점차 증가하였다. 5. 기질에 의한 PTE의 활성을 조사한 결과 Asp. niger의 경우 0.125%의 펙틴을 포함한 용액속에서는 그 활성이 촉진되었으나 그 이상의 기질 농도에서는 효소 활성이 오히려 억제 현상을 나타내었다. 두 종류의 효모균에서도 유사한 결과가 나타났다. 6. 효소 황성에 미치는 KCI, NaCl, MgC $l_2$의 염의 최적 농도를 규명한 결과 KCI과 NaCl은 최저 2$\times$$10^{-4}$M에서 6$\times$$10^{-l}$ M까지의 농도에서는 Asp. niger와 Sac. cerevisiae 유래의 PTE의 활성은 계속 증가하였다. 반면 MgC $l_2$의 경우는 0.2M에서 효소활성이 최적이었다.
Racemic epoxide에 대한 입체선택적 가수분해능을 가지고 있는 곰팡이, Aspergillus niger LK로부터 epoxide hydrolase (EH, EC 3.3.2.3) 유전자의 진화적 유연관계 분석을 행하였다. A. niger LK의 EH 염기서열로부터 유추한 EH 단백질 아미노산 서열은 여러 박테리아의 EH들 및 포유동물의 microsomal EH들과 유의적인 유사성을 가지고 있었으며 a/$\beta$ hydrolase fold family에 속하였다. A. niger LK의 EH 단백질의 입체구조예측은 Protein Data Bank에 수록된 lqo7의 3D 결정구조와 90.6% identity를 가지는 것으로 나타났으며 다른 EH들의 아미노산 서열비교를 행한 결과 Asp$^{192}$ , Asp$^{348}$ 및 His$^{374}$ 이 catalytic triad를 구성하고 있는 것으로 추정되었다. 여러 생물종의 EH서열을 기능적 및 구조적 domain 서열을 기초로 하여 multiple sequence alignment를 행하고 Neighbor-Joining/UPGMA method를 이용하여 계통수를 복원한 결과 다른 생물종들의 EH와의 진화거리는 서로 1.841∼2.682로 멀었으나 EH의 기능을 가지기 위한 oxyanion hole 및 a/$\beta$ hydrolase fold family의 catalytic triad는 잘 보존되고 있어 공통조상으로부터 진화되어 왔음을 알 수 있었다.
1. Cassava 전분(澱粉)을 이용(利用)하여 곰팡이를 $28^{\circ}C$에서 96시간(時間) 액체정치(液體定置) 배양(培養)한 바 배지중(培地中)의 Cassava 전분함량(澱粉含量)이 6%, 72시간(時間)일 때에 균체량(菌體量)이 가장 많았다. 2. Cassava 전분(澱粉)이 6% 함유(含有)된 배지(培地)에서 곰팡이를 배양(培養)하여 얻은 균체단백질량(菌體蛋白質量)은 Rhizopus는 48시간(時間) 배양(培養)하였을때 가장 많았고, Aspergillus niger 및 Aspergillus fumigatus에서는 72시간(時間) 배양(培養)했을 때 균체단백질량(菌體蛋白質量)이 많았다. 3. Cassava 전분량(澱粉量)을 4%, 6% 및 8%되게 변화(變化)시킨 배지(培地)에서 분리균(分離菌)을 접종(接種)하여 96시간(時間) 배양(培養)하면서 24시간(時間)마다 배양여액(培養濾液) 중(中)의 m-amylase의 활성(活性)을 측정(測定)한 바 8% 농도(濃度)에서 Aspergillus niger 및 Aspergillus fumigatus는 72시간(時間)일 때 높은 D.P 값을 얻었고. Rhizopus 는 144시간(時間)일 때 D.P 값이 높았다.
고정화된 Aspenillus niger 세포가 우유공장폐수에서 발효로 구연산을 생산하는데 이용되었다. 구연산 생산균주로서 A. niger ATCC 9142가 3일간 전배양되었으며, 약 2.5∼3.5 mm Ca-alginate beads 로 포획되었다. 최적의 pH와 온도는 각각 3.0과 $30^{\circ}C$였다. 발효에 대한 최적 희석률은 $0.025h^{-1}$ 인 것으로 계산되었다. 구연산의 최대 생산량은 최적화된 발효조건과 함께 4.5 g/$\ell$에서 얻어졌다. 고정화된 Aspergillus niger ATCC 9142에 의해 생산된 구연산의 수율은 70.3%였다. Shake-flask배양실험에 비해 연속식 배양실험 결과가 고정화 세포에 의해 20%증가되었다. 따라서 우유공장폐수는 구연산 발효기질로서의 이용가치가 있다고 볼 수가 있겠다.
우유공장에서 배출되는 폐수를 Aspergillus niger ATCC 9142의 발효기질로 하여 회분식발효기에서 구연산의 생산에 관하여 연구하였다. 구연산의 생산성을 높이기 위하여 각종 금속이온, Mn$^{2+}$, Fe$^{2+}$, Cu$^{2+}$ 및 Mg$^{2+}$ 등을 첨가하여 발효시킨 결과, Mn$^{2+}$, Fe$^{2+}$, Cu$^{2+}$의 첨가시 구연산의 생산이 증가하였으나, Mg$^{2+}$를 첨가한 경우는 오히려 감소하였다. 우유폐수의 환원당 농도를 각가 50g/l 및 100g/l로 농축하여 Aspergillus niger ATCC 9142를 이용하여 생산된 구연산은 7.2g/l 및 16.5g/l 이상이었다. 실험적인 결과에 의한 세포의 성장, 구연산의 생산 및 기질의 소모속도는 수확적인 모델링에 의해 예측한 경우와 잘 일치하고 있음을 알 수 있었다.
Aspergillus niger LK의 epoxide hydrolase (EH)를 codon usage를 고려한 Escherichia coli 균주에서 고효율로 발현할 수 있었다. E. coli에서 잘 사용되지 않는 rare codon에 대한 tRNA 유전자 정보가 들어있는 plasmid를 함유한 E. coli 균주인 Rosetta (DE3)PLysS를 숙주세포로 사용하였다. A. niger EH를 발현시킨 재조합 E. coli를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 혼합물과 반응시켰을 때, (R)-styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해활성이 향상됨을 확인할 수 있었다. 또한 라세믹 기질로부터 입체적으로 고순도인 99% ee 값을 갖는 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 얻을 수 있었다.
난용성(難溶性) 인산염(燐酸鹽) 가용화능(可溶化能)이 있는 Pseudomonas putida 와 Aspergillus niger 를 공시(供試) 균주(菌株)로 하여 산성(酸性) 토양(土壤)인 적황색토(赤黃色土)와 알칼리성(性) 토양(土壤)인 석회질토(石灰質土)에 피망을 재배하며, 선발(選拔)된 난용성(難溶性) 인산염(燐酸鹽) 가용화균(可溶化菌)의 접종효과를 조사(調査)하였다. 재배(栽培) 후(後) 토양(土壤) 유효인산(有效燐酸) 함량(含量)은 적황색(赤黃色) 토양의 무접종(無接種)에 비해 무비구(無肥區) 및 시비구(施肥區)에서는 Aspergillus niger, 볏짚구(區)에서는 Pseudomonas putida 와 Aspergillus niger 접종시(接種時) 유의(有意)하게 높았으나, 석회질토양에서는 뚜렷한 경향을 보이지 않았다. 피망의 인산(燐酸) 흡수량(吸收量)은 알칼리성(性)칸 토양(土壤)인 석회질토양(石灰質土壤)의 Pseudomonas putida 및 Aspergillus niger 접종시(接種時) 볏짚시용구를 제외한 무비구(無肥區) 및 시비구(施肥區)에서 증가(增加)하였다. Cellulase 활성(活性)은 접종에 의한 처리간 뚜렷한 차이는 없었으나 적황색(赤黃色) 토양(土壤)의 볏짚 시용구에서 가장 높았다. Phosphatase 활성은 적황색(赤黃色) 토양(土壤)에서는 Aspergillus niger 가 접종(接種)된 모든 처리에서 증가(增加)하였으며, 그 중 시비구(施肥區)와 볏짚 시비구(施肥區)에서는 유의성(有意性)이 있었고, 석회질토양(石灰質土壤)에서는 인산염(燐酸鹽) 가용화균(可溶化菌)이 접종된 모든 처리에서 증가하였으며, 특히 시비구(施肥區)에서는 Aspergillus niger, 볏짚구(區)에서는 Pseudomonas putida 접종시(接種時) 유의성(有意性)있게 증가(增加)하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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