• 생명과학회지
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• 제20권8호
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• pp.1166-1172
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• 2010

Kinesin-I은 4분자의 단백질로 구성되어 있으며, N-말단의 motor 영역과 C-말단영역을 가지는 장쇄(KHC, 또한 KIF5s로도 통용) 2분자와 KIF5s (KIF5A, KIF5B와 KIF5C)의 줄기영역과 결합하는 단쇄(KLC) 2분자로 구성되어 있다. KIF5A의 결합 단백질을 동정하기 위하여 효모 two-hybrid system을 사용하여 특이적으로 결합하는 heterotrimeric G 단백질의 ${\beta}$ 단위체 단백질($G{\beta}$)을 분리하였다. $G{\beta}$은 KIF5A의 808에서 935아미노산 부위와 결합하며, 다른 KIF5들과도 결합함을 효모 two-hybrid assay로 확인하였다. 또한 $G{\beta}$의 WD40 반복 서열은 KIF5A와의 결합에 필수영역임을 확인하였으며, 이러한 단백질간의 결합은 Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay를 통하여 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액에 KIF5들의 항체로 면역침강을 행하여 heterotrimeric G 단백질을 확인한 결과, KIF5들은 heterotrimeric G 단백질과 특이적으로 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 kinesin-I는 heterotrimeric G 단백질이 포함된 소포를 미세소관을 따라 이동시킴을 시사한다.

• 생명과학회지
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• 제22권12호
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• pp.1608-1613
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• 2012

KIF5/Kinesin-I는 경쇄(light chain)를 통하여 결합함으로써 다양한 운반체들을 미세소관을 따라 운반한다. Kinesin light chains (KLCs)은 tetratricopeptide repeat (TPR) 영역을 매개로 운반체와 결합한다. 현재까지 KLCs와 결합하는 많은 운반체들이 확인되었으나 KLCs가 어떻게 특정운반체를 인식하여 결합하는지는 아직 확실히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 KLC1의 TPR 영역과 결합하는 단백질을 분리하기 위하여 효모 two-hybrid system을 이용하여 탐색한 결과 amyloid precursor protein (APP)과 결합하는 것으로 보고된 protein interacting with APP tail 1 (PAT1)을 분리하였다. KLC1은 PAT1의 C-말단 부위와 결합하며, PAT1은 KLC1의 TPR 영역을 포함한 부위와 결합함을 효모 two-hybrid assay로 확인하였다. 또한 PAT1는 KLC2와도 결합하였지만 kinesin heavy chains (KHCs)인 KIF5A, KIF5B, KIF5C와는 결합하지 않았다. 단백질간 결합은 glutathione S-transferase (GST) pull-down assay와 공동면역침강으로도 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액을 PAT1 항체와 APP 항체로 면역침강을 행한 결과 KLC와 KHCs가 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 PAT1이 Kinesin-I와 APP 포함 소포간의 상호작용을 매개한다는 것을 시사한다.

• 생명과학회지
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• 제21권9호
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• pp.1226-1233
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• 2011

키네신은 신경세포에서 미세소관 위를 따라 소포들을 운반하는 분자 motor 단백질로 4개의 단백질로 구성되어있다. 신경세포내에서 발현하는 KIF5C가 세포 내에서 어떤 특정소포를 이동시키는가는 신경세포성장에서 중요문제이다. 이에 본연구는 KIF5C와 결합하는 단백질을 동정하기 위하여 효모 two-hybrid 방법을 사용하여 KIF5C와 특이적으로 결합하는 $\underline{S}$am68-$\underline{l}$ike $\underline{m}$ammalian protein 2 (SLM-2)을 확인하였다. $\underline{S}$ignal $\underline{T}$ransducers and $\underline{A}$ctivators of $\underline{R}$NA (STAR) family의 한 종류이며 RNA processing에 관여하는 RNA 결합단백질인 SLM-2는 KIF5s의 C-말단과 결합하며, 또한 SLM-2의 C-말단은 KIF5s와 결합하는데 필수영역이였다. 이러한 단백질간의 결합은 Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay를 통하여 SAM68, SLM-1, SLM-2은 특이적으로 Kinesin-I과 결합함을 확인하였으며, SAM68의 항체로 면역침강한 결과 KIF5s와 mRNA는 같이 침강하였다. 신경 세포의 말단에는 돌기형성에 필요한 단백질들의 주형인 mRNA가 다수 존재하며, 이러한 mRNA는 세포의 중앙에서 세포의 말단쪽으로 이동하여야 하는데, 이번 연구 결과는 Kinesin-I이 특이적으로 mRNA을 운반할 것으로 예상된다.

• 생명과학회지
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• 제21권8호
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• pp.1076-1082
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• 2011

미세소관(microtubule) 위를 이동하는 키네신은 분비소포를 이동시키는 운동단백질이다. KIF5s (KIF5A, KIF5B and KIF5C)는 세포막으로 싸인 각종 세포 내 소기관과 결합하여 미세소관을 따라 목적지까지 이동시킨다는 결과는 알려져 있지만, 어떻게 상대의 cargo를 인식하는지는 밝혀지지 않았다. 본 연구는 KIF5B의 결합 단백질을 동정하기 위하여 효모 two-hybrid system을 사용하여 KIF5B와 특이적으로 결합하는 Myo9b을 확인하였다. Myo9b는 액틴위를 이동하는 운동단백질로 다른 KIF5s들과도 결합함을 효모 two-hybrid assay로 확인하였다. 또한 Myo9s의 GTPase 활성화 단백질(GAP) 영역은 KIF5B와 결합하는데 필수영역임을 확인하였고, 이러한 단백질간의 결합은 Glutathione S-transferase (GST) pull-down assay를 통하여서도 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액에 KIF5B들의 항체로 면역침강을 행하여 Myo9s 단백질을 확인한 결과, KIF5s는 Myo9s 단백질과 특이적으로 함께 침강하였다. 이러한 결과들은 kinesin-I는 액틴 결합 운동단백질과 직접 결합함을 보여준다.

• 생명과학회지
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• 제17권7호통권87호
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• pp.889-895
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• 2007

KIF5는 2분자의 kinesin heavy chain (KHC)과 2분자의 kinesin light cham (KLC)으로 구성되며 미세소관과 직접 결합한다. KIF5는 여러가지 세포 내 소기관을 이동시키나 KIF5가 이동시키는 운반체가 어떻게 특이적으로 결합하는지는 아직 밝혀지지 못하였다. 본 연구에서 효모 two-hybrid system을 사용하여 KLC1의 tetratricopeptide repeats (TRP) 부위와 결합하는 세포 내의 단백질을 분리하였다. 결과 KLC1와 특이적으로 결합하는JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1/JIP3)을 분리하였다. 이러한 결합은 KLC1의 TRP1, 2 영역과 JSAP1의 leucine zipper 영역이 결합에 관여하며, 또한 효모 two-hybrid assay에서 JSAP1은 KLC2와 결합하지만 신경세포에서 발현하는 KIF5A, KIF5C 그리고 모든 세포에서 발현하는 KIF5B와는 결합하지 않았다. 단백질간의 결합을 pull-down assay로 확인한 결과 KLC1은 glutathione S-transferase (GST)와는 결합하지 않으나 GST결한 JSAP1과는 결합하였다. 또한 생쥐의 뇌 파쇄 액으로부터 JSAP1 항체로 면역침강을 행한 결과 KLC1은 JSAP1과 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 KLC1은 JSAP1과 결합하며, JSAP1은 KLC1의 수용체로세포 내 KIF5의 수송의 매개 단백질로 작용함을 시사한다.

• 생명과학회지
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• 제22권3호
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• pp.293-297
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• 2012

분자 운동 단백질은 신경세포 내의 세포체에서 특정 목적지까지 소포를 이동시키는데 관여한다. 오징어의 거대 축삭은 간단한 제거조작으로 축삭을 분리 가능하기 때문에 신경세포내 물질이동기전 연구의 좋은 모텔로 활용 가능하다. 이전연구에서 오징어 거대축삭의 소포들은 미세소관을 따라 이동하는 키네신 항체에 의하여 운반됨이 확인되었다. 본 연구는 오징어 뇌에 존재하는 키네신들을 크로닝하고, 분리된 유전자의 분석을 행하기 위하여 키네신 운동 도메인에서 잘 보존된 아미노산 배열에 해당되는 영역에 DNA primer을 이용하여 새로운 6종류의 키네신을 분리하였다. 오징어의 키네신들과 생쥐의 키네신들의 motor 영역의 아미노산분석에서 보존된 영역이 존재하며, Maximum Parsimony (MP) 방법, Neighbor-Joining (NJ) 방법, Minimum Evolution (ME) 방법, 그리고 Maximum likelihood (ML) 방법을 기초로 한 계통분석에서 생쥐의 키네신과 높은 상동성을 나타내었으며, 또한 계통수에서도 높은 상관관계가 확인되었다.

• BMB Reports
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• 제45권8호
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• pp.427-432
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• 2012

Primary cilia, single hair-like appendage on the surface of the most mammalian cells, were once considered to be vestigial cellular organelles for a past century because of their tiny structure and unknown function. Although they lack ancestral motility function of cilia or flagella, they share common ground with multiciliated motile cilia and flagella on internal structure such as microtubule based nine outer doublets nucleated from the base of mother centrioles called basal body. Making cilia, ciliogenesis, in cells depends on the cell cycle stage due to reuse of centrioles for cell division forming mitotic spindle pole (M phase) and assembling cilia from basal body (starting G1 phase and maintaining most of interphase). Ciliary assembly required two conflicting processes such as assembly and disassembly and balance between these two processes determines the length of cilia. Both process required highly conserved transport system to supply needed substance to grow tip of cilia and bring ciliary turnover product back to the base of cilia using motor protein, kinesin and dynein, and transport protein complex, IFT particles. Disruption of ciliary structure or function causes multiple human disorder called ciliopathies affecting disease of diverse ciliated tissues ranging from eye, kidney, respiratory tract and brain. Recent explosion of research on the primary cilia and their involvement on animal development and disease attracts scientific interest on how extensively the function of cilia related to specific cell physiology and signaling pathway. In this review, I introduce general features of primary cilia and recent progress in understanding of the ciliary length control and signaling pathways transduced through primary cilia in vertebrates.

• 생명과학회지
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• 제15권2호
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• pp.253-260
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• 2005

인체 MCAK 단백질을 Escherichia. coli에서 재조합 단백질로 발현하였다. 이를 SDS-PAGE 후 electroelution으로 정제하고 항원으로 사용하여 rat에서 다클론성 항체생성을 유도한 결과, 생성된 항체는 Western blot analysis에 의해 인체 MCAK 단백질 (81 kDa)을 특이적으로 인식할 수 있었으며, Jurkat T cells과 293T cells에 있어서 MCAK 단백질의 대부분이 핵 내에 위치함을 확인할 수 있었다. 세포주기에 따른 MCAK 단백질의 발현양의 변화를 조사하기 위해, Jurkat T cells을 Hydroxy urea 또는 Nocodazole의 처리로 $G_{1}/S$ boundary 그리고 $G_{2}/M$ boundary에 blocking하고 이로부터 release 시키는 시간을 달리하여 다양한 세포주기상에 위치한 Jurkat T cells을 확보하였다. 각각의 Jurkat T cells로부터 cell lysate를 얻어서 Western blot analysis를 시도한 결과, MCAK 발현양은 S phase에서 가장 높았으며 MCAK의 SDS-PAGE상의 mobility가 81 kDa에서 84 kDa로 shift됨을 확인하였다. MCAK의 전기영동상의 mobility shift에 의한 slow moving $p84^{HsMCAK}$는 S phase 후반부터 나타나기 시작하며 $G_{2}/M$ phase에 최대였고 $G_{1}$, phase에서는 확인되지 않았다. 이는 세포주기에 따라 MCAK의 단백질의 인산화 양상이 달라짐을 시사한다. 생성된 항체를 이용한 Immunocytochemical analysis의 결과, 인체 MCAK 단백질은 세포주기의 interphase에서는 주로 중심체와 핵에 존재하며, M phase의 각 단계에 따라서 spindle pole, centromere, spindle fiber 또는 midbody에 존재함을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 E. coli에서 발현된 재조합 HsMCAK 단백질을 항원으로 하여 rat에서 생산한 다클론성 항체가 HsMCAK 단백질을 특이적으로 인식할 수 있음과 또한 HsMCAK 단백질의 인산화를 나타내는 SDS-PAGE상의 mobility-shift가 $G_{2}/M$ phase에 최대에 도달하는 양상으로 세포주기에 따라 변동됨을 나타내며, HsMCAK의 인산화와 HsMCAK의 세포 내 위치간의 관련성을 시사한다. 아울러 이러한 연구결과는 hamster 및 Xenopus 등에서 주로 연구되고 있는 MCAK의 세포주기상의 주요기능이 인체세포에도 적용될 수 있음을 시사한다.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제23권6호
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• pp.539-547
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• 2019

Anoctamin 5 (ANO5)/TMEM16E belongs to a member of the ANO/TMEM16 family member of anion channels. However, it is a matter of debate whether ANO5 functions as a genuine plasma membrane chloride channel. It has been recognized that mutations in the ANO5 gene cause many skeletal muscle diseases such as limb girdle muscular dystrophy type 2L (LGMD2L) and Miyoshi muscular dystrophy type 3 (MMD3) in human. However, the molecular mechanisms of the skeletal myopathies caused by ANO5 defects are poorly understood. To understand the role of ANO5 in skeletal muscle development and function, we silenced the ANO5 gene in C2C12 myoblasts and evaluated whether it impairs myogenesis and myotube function. ANO5 knockdown (ANO5-KD) by shRNA resulted in clustered or aggregated nuclei at the body of myotubes without affecting differentiation or myotube formation. Nuclear positioning defect of ANO5-KD myotubes was accompanied with reduced expression of Kif5b protein, a kinesin-related motor protein that controls nuclear transport during myogenesis. ANO5-KD impaired depolarization-induced $[Ca2^{+}]_i$ transient and reduced sarcoplasmic reticulum (SR) $Ca^{2+}$ storage. ANO5-KD resulted in reduced protein expression of the dihydropyridine receptor (DHPR) and SR $Ca^{2+}-ATPase$ subtype 1. In addition, ANO5-KD compromised co-localization between DHPR and ryanodine receptor subtype 1. It is concluded that ANO5-KD causes nuclear positioning defect by reduction of Kif5b expression, and compromises $Ca^{2+}$ signaling by downregulating the expression of DHPR and SERCA proteins.