본 연구에서는 담수사육 감성돔을 대상으로 수온을 상승시켰을 때, 세포적 스트레스 측면에서 HSP90 및 HSP70 mRNA의 발현 정도를, 신경-내분비적 스트레스 측면에서 혈장 cortisol 및 glucose 농도를 조사하였다. RT-PCR법을 이용하여 생식소로부터 HSP90 (891 bp) 및 HSP70 (465 bp) cDNA 단편을 클로닝 하여, 타 종과 그 상동성을 비교해 본 결과, 감성돔 HSP90은 참돔 HSP90과 99%, 무지개송어 HSP90과 95%, 대서양 연어HSP90과 94%, zebrafish HSP90과 94%로 나타났으며, 감성돔 HSP70은 무지개송어 HSP70과 96%, silver seabream HSP70과 95%, zebrafish HSP70과 95%의 상동성을 나타내었다. 감성돔의 사육수온을 $30\;^{\circ}C$로 상승시켰을 때, HSP90 mRNA는 모든 조직에서 그 발현 정도가 $20\;^{\circ}C$ 실험구에 비하여 $7{\sim}9$배 정도 높았으나, HSP70 mRNA는 생식소에서만 발현하는 것으로 나타났다. 혈장 cortisol 및 glucose 농도는 $20\;^{\circ}C$ 실험구에 비하여 $30\;^{\circ}C$ 실험구에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다.
한국의 고급 양식대상 어종인 붉바리(Epinephelus akaara)로부터 새로운 heat shock protein (Hsp) 70을 동정하였다. 붉바리 Hsp70 (RgHsp70)의 cDNA는 RACE (rapid amplification of cDNA ends)법을 사용하였고, RgHsp70 cDNA의 전장은 2,152 bp이고, 5'-terminal untranslated region (UTR)은 105 bp, 3'-terminal UTR은 274 bp, 590개의 아미노산을 암호화하는 open reading frame (ORF)는 1,773 bp였으며, 분자무게(molecular weight)는 64.9 kDa 및 등전위값(isoelectric point, pI)은 5.2였다. 추정되는 아미노산 비교 및 계통발생학적 분석 결과, 다른 어종과 마찬가지로 Hsp70 고유의 signature를 포함하는 것을 비롯하여 높은 유사성을 나타내었으므로 RgHsp70이 Hsp70 family임을 확인할 수 있었다 RgHsp70 mRNA는 간과 두신 조직에서 높은 발현을 보였으며, 48시간 동안 수온별(21, 18, 15 및 $12^{\circ}C$) 노출 후 간 조직에서 대조구인 $21^{\circ}C$보다 $12^{\circ}C$에서 발현이 증가함을 확인하였다. 본 연구에서는, 수온이 하강함에 따라 RgHsp70 mRNA 발현에 주요한 영향을 미치는 것으로 보아, 수온변화에 따른 스트레스로 인해 발현의 변화를 나타내는 주요 스트레스성 단백질임을 확인할 수 있었다.
목 적 : 폐포상피세포의 LPS 전처치 여부에 따라 HSP70 유도가 추가 LPS 자극에 의한 IL-6 생성능 및 세포생존도에 미치는 영향과 그 기전에 HSP70이 관여하는 지를 관찰하였다. 방 법 : 쥐의 폐포상피세포를 배양하여 LPS 전처치군과 비처치군으로 분류한 후, 각 군을 다시 대조군, quercetin 단독투여군, HSP70 유도군, HSP70 억제군으로 나누어 추가 LPS자극 후에 HSP70 발현, IL-6 생성능 및 세포생존도를 관찰하였다. HSP70 유도에는 sodium arsenite(SA)를, HSP70 억제에는 quercetin을 사용하였으며, HSP70 발현은 western blot으로, IL-6 생성능은 ELISA로 측정하였다. 세포생존도는 단순화한 MTT 측정법으로 관찰하였다. 결 과 : 세포 생존도에 영향을 미치지 않으면서 충분한 HSP70 발현을 유도하는 SA 농도는 $50{\mu}M$, HSP70 발현을 억제하는 quercetin 농도는 $100{\mu}M$이었다. LPS 전치치 여부에 상관없이 HSP70 유도군은 대조군에 비해 추가 LPS자극에 의한 IL-6 생성능이 현저히 감소하였으며, HSP70 억제군은 HSP70 유도군에 비해 추가 LPS자극에 의한 IL-6 생성능이 유의하게 다시 증가하였다. 세포생존도는 LPS 비처치군에서는 각 실험군이 대조군에 비해 유의하게 증가하였지만, LPS 전처치군에서는 각 군 간에 차이가 없었다. 결 론 : 이와 같은 결과는 쥐폐포상피세포에서 LPS 전처치 후에 HSP70 유도를 하면 세포생존도에는 영향을 미치지 않으면서 추가 LPS 자극에 따른 IL-6 생성능이 억제되며, 이러한 현상이 나타나는 기전에는 HSP70 자체가 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.
This study examined the expression of heat shock protein 70 (Hsp70) in red seabream Pagrus major infected by the, acanthocephalan parasites Longicollum pagrosomi. We cloned the full-length Hsp70 cDNA from the liver of the red seabream. The full-length cDNA had a 1,950 bp open reading frame (ORF) that encoded a protein of 650 amino acids. The deduced amino acid sequence of Hsp70 contained all of the conserved Hsp70 family signature sequences and an adenosine triphosphate (ATP)/guanosine triphosphate (GTP) binding motif, including the EEVD (consensus sequence that terminates in Hsp70 family) consensus sequence. The expression of Hsp70 mRNA was upregulated int the fish head-kidney and liver, as determined by quantitative real-time PCR. We quantified the Hsp70 mRNA expression in normal red seabream and fish infected fish by L. pagrosomi. The expression of Hsp70 mRNA was significantly higher in the infected red seabream. These results suggest that Hsp70 play a role of protection against stress and inflammation caused by the parasite and may help maintain homeostasis.
To study the functioning of HSP70 in Escherichia coli, we selected NtHSP70-2 (AY372070) from among three genomic clones isolated in Nicotiana tabacum. Recombinant NtHSP70-2, containing a hexahistidine tag at the amino-terminus, was constructed, expressed in E. coli, and purified by $Ni^{2+}$ affinity chromatography and Q Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography. The expressed fusion protein, $H_6NtHSP70$-2 (hexahistidine-tagged Nicotiana tabacum heat shock protein 70-2), maintained the stability of E. coli proteins up to 90$^{\circ}C$. Measuring the light scattering of luciferase (luc) revealed that NtHSP70-2 prevents the aggregation of luc without ATP during high-temperature stress. In a functional bioassay (1 h at 50$^{\circ}C$) for recombinant $H_6NtHSP70$-2, E. coli cells overexpressing $H_6NtHSP70$-2 survived about seven times longer than those lacking $H_6NtHSP70$-2. After 2 h at 50$^{\circ}C$, only the E. coli overexpressing $H_6NtHSP70$-2 survived under such conditions. Our NtHSP70-2 bioassays, as well as in vitro studies, strongly suggest that HSP70 confers thermo-tolerance to E. coli.
열충격단백질 70 (HSP70)은 복수유전자족으로서 통상적으로 표현되는 Hsc70와 스트레스에 의하여 유도되는 Hsp70가 있다. 포유동물의 신경계통에서는 상당한 량의 HSP70가 정상조건에서도 표현되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 흰쥐의 소뇌 세포의 연접에서 Hsp70의 표현에 대한 연구를 하였다. 면역조직화학적으로 소뇌절편을 염색하여 관찰한 결과 Hsp70와 Hsc70 모두 표현되었는데, 소뇌 조롱박세포에서 가장 강하게 표현되었으며, 다음으로 소뇌 과립세포에서 강하게 표현되었다. 또한 깊은소뇌핵의 신경세포들도 강하게 염색되었다. 배양한 P1 소뇌신경 세포를 Hsp70 항체로 염색한 결과 Hsp70는 조롱박세포와 과립 세포에서 모두 표현되었으며, 세포체와 가지돌기를 따라 점박이를 형성하였다. 이들 점 박이들은 PSD95 점박이와 같이 위치하였다. 그리고 PSD 분획을 이용한 면역염색에서도 PSD70이 검출되었다. 본 연구결과는 Hsp70이 정상조건에서도 소뇌신경세포의 연접에 존재함을 의미한다.
고온 단백질 heat shcok protein 70 (HSP70)은 분자샤페론으로써 환경스트레스와 발달단계 동안 단백질을 보호하고 합성하는 다양한 과정에 관여하는 기본적인 단백질이다. 하지만 그 생물학적 기능이 식물에서 아직 정확하게 밝혀지지 않았다. 이에 본 연구에서는 담배에서 고온에 의해 유도된 HSP70인 NtHSP70-1 (AY372069)를 분리하여 그 기능을 연구하였다. NtHSP70-1의 고온 내성 기능을 분석하기 위해 NtHSP70-1이 식물 형질전환용 벡터인 pBKS1-1에 sense 또는 antisense 방향으로 도입되어 형질전환된 식물체와 pBKS1-1만 도입된 형질전환 식물체들을 제조하였다. 형질전환체에 있어서 NtHSP70-1의 발현량은 western blot 분석법을 사용하여 수행하였고 확인된 형질전환체들은 고온 내성 기능분석에 이용되었다. 그 결과 고온 환경에 있어서 NtHSP70-1이 과다발현된 형질전환체들은 그 클로로필의 함량과 생존율이 정상환경 일 때와 유사하였고 반대로 벡터 또는 벡터인 pBKS1-1에 antisense 방향으로 도입되어 형질전환된 식물체들은 클로로필의 파괴로 인한 감소된 생존율을 나타내었다. 고온 처리된 형질전환 식물체에서 클로로필의 함량비교 결과로 NtHSP70-1이 클로로필을 보호함으로써 식물의 고온내성에 기여함을 알 수 있었다.
We have investigated whether HspBP1, a Hsp70 binding protein, could have effect on the assembly of the bovine progesterone receptor (bPR) with a chaperone complex consisting of bovine Hsp90 (bHsp90), bovine Hsp70 (bHsp70), Hop, Ydj-1, and p23. The bPR, isolated in its native conformation, loses its function to interact with progesterone hormone in the absence of this protein complex. However, in the presence of bHsp90, bHsp70, Hop, p23 and Ydj-1, its function could be restored in vitro. Our findings here indicate that the inclusion of HspBP1 to five-protein system prevented the proper assembly of progesterone receptor-chaperone complex and induce the loss of bPR ability to interact with hormone. Immunoprecipitation assays of bPR with HspBP1 show that the presence of HspBP1 did not have any effect on the assembly of Ydj-1 and bHsp70 with the progesterone receptor. However, further assembly of Hsp90, Hop and p23 was completely prevented and the function of the bPR was lost. In vitro competition and protein folding assays indicated that the binding of HspBP1 to bHsp70 prevented the ternary complex formation of bHsp70, bHsp90, and Hop. These results indicate that HspBP1 is a negative regulator of the assembly of Hsp90, Hop and Hsp70, and thus, prevent the proper maturation of unliganded bPR with chaperones assembly system.
Background: Heat-shock protein70 (HSP70) are intracellular protein chaperones, with emerging evidence of their association with various diseases. We have previously reported significantly elevated plasma-HSP70 (pHSP70) in pancreatic cancer. Current methods of pHSP70 isolation are ELISA-based which lack specificity due to cross-reactivity by similarities in the amino-acid sequence in regions of the protein backbone resulting in overestimated HSP70 value. Materials and Methods: This study was undertaken to develop a methodology to capture all isoforms of pHSP70, while further defining their tyrosine and serine phosphorylation status. Results: The methodology included gel electrophoresis on centrifuged supernatant obtained from plasma incubated with HSP70 antibody-coupled beads. After blocking non-specific binding sites, blots were immunostained with monoclonal-antibody specific for human-HSP70, phosphoserine and phosphotyrosine. Conclusions: Our novel immunocapture approach has distinct advantages over the commercially available methods of pHSP70 quantification by allowing isolation of molecular aggregates of HSP70 with additional ability to precisely distinguish phosphorylation state of HSP70 molecules at serine and tyrosine residues.
Seo, Hang-Rhan;Chung, Hee-Yong;Lee, Yoon-Jin;Baek, Min;Bae, Sang-Woo;Lee, Su-Jae;Lee, Yun-Sil
Nuclear Engineering and Technology
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제38권3호
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pp.285-292
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2006
Thermoresistant (TR) clones of radiation-induced fibrosarcoma (RIF) cells have been reported to show an adaptive response to 1cGy of low dose radiation, and HSP25 and inducible HSP70 are involved in this process. In this study, to further elucidate the mechanism by which HSP25 and inducible HSP70 regulate the adaptive response, HSP25 or inducible HSP70 overexpressed RIF cells were irradiated with 1cGy and the cell cycle was analyzed. HSP25 or inducible HSP70 overexpressed cells together with TR cells showed increased G1 phase after 1cGy irradiation, while RIF cells did not. $[^3H]-Thymidine$ and BrdU incorporation also indicated that both HSP25 and inducible HSP70 are involved in G1 arrest after 1cGy irradiation. Molecular analysis revealed upregulation of p27Cip/Kip protein in HSP25 and inducible HSP70 overexpressed cells, and cotransfection of p27Cip/Kip antisense abolished the induction of the adaptive response and 1cGy-mediated G1 arrest. The above results indicate that induction of an adaptive response by HSP25 and inducible HSP70 is mediated by upregulation of p27Cip/Kip protein, resulting in low dose radiation-induced G1 arrest.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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