제주도 연안의 해수로부터 항산화물질을 생산하는 세균을 분리하였으며 항산화물질의 특성을 조사하였다. 분리된 항산화 생성 균주는 그람양성의 통성혐기성균으로 운동성을 가진 단간균이었으며 생육시 NaCl를 필요로 하였다. 분리균주는 형태학적, 배양적, 생화학적 특성 및 165 rDNA 염기서열 분식결과 Exiguobacterium 속으로 동정되어 Ekiguobaoteriurn sp. SC2-1로 명명하였다. 항산화물질 생산균주 배양액의 radical 소거활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 법을 사용하였으며, 항산화물질 생성 최적조건은 $25^{\circ}C,\;NaCl\;4\%,\;pH\;6\~8$ 이었으며, 최적 탄소원은 $1\%$ maltose였다. 배양액의 hydroxyl radical 소거활성은 $73\%$였으며 superoxide radical 소거활성은 $35\%$를 나타내었다.
About 3,000 bacterial colonies with esterase activities were isolated from soil samples by enrichment culture and halo-size on Luria broth-tributyrin (LT) plates. The colonies were assayed for esterase activity in microtiter plates using enantiomerically pure (R)- and (S)-2-phenylbutyric acid resorufin ester (2PB-O-res) as substrates. Two enantioselective strains (JH2 and JH13) were selected by the ratio of initial rate of hydrolysis of enantiomerically pure (R)- and (S)-2-PB-O-res. When cell pellets were used, both strains showed high apparent enantioselectivity ($E_{app}>100$) for (R)-2PB-O-res and were identified as Exiguobacterium acetylicum. The JH13 strain showed high esterase activity on p-nitrophenyl acetate (pNPA), but showed low lipase activity on p-nitrophenyl palmitate (pNPP). The esterase was located in the soluble fraction of the cell extract. The crude intracellular enzyme preparation was stable at a pH range from 6.0 to 11.0.
We isolated and identified three protease-producing bacteria that had inhabited the region around the Korean Arctic Research Station Dasan located at Ny-Alesund, Svalbard, Norway $(79^{\circ}N,\;12^{\circ}E)$. Biofilms were collected from the surface of a floating pier and from dead brown algae in a tide pool near the seashore. The biofilm samples were transported to the Korea Polar Research Institute (KOPRI) under frozen conditions, diluted in sterilized seawater, and cultured on Zobell agar plates with 1% skim milk at $10^{\circ}C$. Three clear zone forming colonies were selected as protease-producing bacteria. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences showed that these three stains shared high sequence similarities with Pseudoalteromonas elyakovii, Exiguobacterium oxidotofewm Pseudomonas jessenii, respectively. We expect these Arctic bacteria may be used to develop new varieties of protease that are active at low temperatures.
본 연구는 토양으로부터 분리한 균주를 대상으로 식물병 방제활성 및 식물 생장촉진 활성을 확인하고자 하였다. 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능을 통해 방제기능을 확인할 수 있었으며, 이는 siderophore 및 항생물질 생성 등에 기인되는 것으로 판단된다. 또한 ANG40의 경우에는 amylase, cellulase, xylanase와 같은 세포외 효소활성을 갖고 있음을 확인하였다. 이 외에도 질소 고정능, 인산 가용화능, siderophore 생성능 등 다양한 실험을 통해 식물 생장에 필수적인 질소, 인, 철 등을 식물이 흡수 가능한 형태로 변화시켜 식물 생장에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 또한 6종의 분리균주는 모두 에틸렌 생성과 연관된 IAA를 생성하였으며, 그 중에서도 ANG51의 경우에는 ACC deaminase 활성도 갖고 있음을 확인하였다. 따라서, 최종 선별된 Pseudomonas geniculata ANG3, Exiguobacterium acetylicum ANG40, Burkholderia stabilis ANG51을 이용하여 식물 생장촉진 활성과 식물 병원성 곰팡이에 항진균 활성을 갖는 새로운 생물학적 제제로써 이용 가능성을 제시하였다.
Exiguobacterium sp. 유래의 $\beta$-glucosidase 고정을 위하여 글루타르알데하이드를 사용한 키토산 비드를 조제하였다. 키토산 비드의 교차결합 및 고정화의 조건을 최적화하였다. $\beta$-glucosidase 고정화의 최적생산 조건에서 20%의 수율과 5.22 U/g의 효소활성을 나타냈다. 최적 pH 와 온도는 9.0과 $55^{\circ}C$를 나타냈다. 고정된 효소의 안정성은 pH 7.0-10.0에서는 80%, $40^{\circ}C$ 2시간 반응에서는 80% 및 $50^{\circ}C$ 1시간 반응에서는 48%의 활성을 보유하였다. 이러한 결과는 높은 pH와 고온에서 비고정 효소보다 안정성을 보여주었다. 고정된 효소를 가지고 대두 이소플라본 배당체의 높은 가수분해능을 확인하였다. 이상의 결과는 고정화 효소의 다양한 이용 가능성을 시사하였다.
Glutaraldehyde was used as a cross-linking agent for immobilization of purified ${\alpha}$-amylase from Exiguobacterium sp. DAU5. Befitting concentration of glutaradehyde and cross-linking time is the key to preparation of cross-linking chitosan beads. Based on optimized immobilization condition for ${\alpha}$-amylase, an overall yield of 56% with specific activity of 2,240 U/g on chitosan beads and 58% with specific activity of 2,320 U/g on chitosan-carbon beads was obtained. The optimal temperature and pH of each immobilized enzyme activity were $50^{\circ}C$ and 50 mM glycine-NaOH buffer pH 8.5, respectively. Those retained more than 75 and 90% of its maximal enzyme activity at pH 7.0-9.5 and after incubation at $50^{\circ}C$ for 1 h, respectively. In addition, the immobilization product showed higher organic-solvent tolerance than free enzymes. The mode of hydrolyzing soluble starch revealed that the ${\alpha}$-amylase possessed high hydrolyzing activity. These results indicate that chitosan is good support and has broad application prospects of enzyme immobilization.
합성 항산화제에 대응할 수 있는 천연 항산화제의 개발에 대한 기초적인 자료를 제공하고자 해양 미생물을 이용한 연구를 하였으며, 전자공여능으로 항산화 물질 생산 능력이 우수한 해양 미생물을 분리하여 SC2-1라고 명명하였다. 분리 균주 SC2-1은 제주 연안 해수로부터 분리하였으며, 생화학적, 유전학적, 세포벽의 지방산 조성을 토대로 최종적으로 Exiguobacteriurm sp. SC2-1로 동정 하였다. 항산화물질을 생산을 위한 최적 배양조건 및 영양원을 조사한 결과는 다음과 같다. 항산화물질 생성 최적 온도는 $25^{\circ}C$이고, 최적 pH는 7.8이며 최적 배양시간은 24시간이었다. 항산화물질 생산 최적 배지조성은 기본배지로 Marine broth에 탄소원으로는 maltose 였으며, 적정농도는 $2.5\%(w/v)$ 였다 질소원에서는 유기태 질소원인 yeast extract이었고, yeast extract 최적농도는 $1.5\%(w/v)$였으며, 최적 무기염류는 $0.05\%(w/v)KH_{2}PO_{4} $를 첨가 했을때 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다. 최적배지 조건에서의 Exiguobacterium sp. SC2-1 배양액의 항산화 활성과 합성 항산화제, 천연 항산화제와의 비교실험 결과는 균주의 전자 공여능은 $93\∼95\%$, 합성 항산화제인 BHT와 BHA는 $94\∼95\%$, 천연 항산화제 $\alpha-Tocopherol$은 $94\%$로 거의 유사한 항산화 활성을 확인 할 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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