The ability of microspores or young pollen grains (male gametophytes) to undergo developmetal switch to embryogenic (sporophytic) pathway exemplifies the concept of totipotency as applied to haploid posmeiotic cells. As a first step pollen is devoid of positional information provided in situ by the intact anther - by isolation and cultivation in vitro in artificial media. This is inevitably accompanied by some degree of stress response in microspore/pollen. It has been shown in both monocots and dicots that intentional stress treatment (mostly starvation or heat shock) greatly stimulates embryo induction rate. Using transgenic sHSP antisense Nicotiana tabacum we show that expression of small heat shock proteins is an integral part of successful embryo and later haploid plant production from pollen grains. Our recently published data show that sHSP chaperone function is optimal in the absence of ATP.
본 실험은 강활(O. koreanum)과 지리강활(A.purpuraefolia)의 체세포배 발생을 위한 효율적인 세포배양시스템을 확립하고자 실시하였다. 강활과 지리강활의 개화후 3주된 미숙종자는 0.1 mg/L 2,4-D와 0.1 mg/L BA 혼용처리구에서 배발생캘러스와 체세포배 발생이 가장 양호하였고, 0.1-3.0mg/L NAA가 처리된 배지에서 재분화된 식물체의 자엽과 배축의 가장자리로부터 직접 체세포배가 발생하였다. 미숙종자의 휴면을 고려하여 저온처리한 결과, 5$^{\circ}C$에서 10일동안 저장 후, 25$\pm$2$^{\circ}C$에서 배양하였을 때 반응이 없던 배양체로부터 배발생 캘러스와 체세포배가 발생하였고 이 체세포배는 줄기와 뿌리로 분화되었다. 지리강활에서는 배지내 첨가한 glutamine과 coconut milk의 뚜렷한 효과가 인정되지 않았다. 그러나 강활의 경우에는 대조구에 비하여 glutamine과 10% coconut milk가 포함된 배지에서 체세포배 발생률이 항상되었고 특히 glutamine은 coconut milk에 비해 NH$_4$NO$_3$ 대체효과가 인정되었다. 체세포배의 器內 식물체전환율은 MS 기본배지에서 89.1%로 가장 양호하였고 배발생 캘러스의 증식용 배지로는 0.01 mg/L 2,4-D와 0.01 mg/L BA혼용처리구에서 가장 좋았다.
본 연구는 미나리의 배발생 캘러스를 배양하여 정상적이고 균일한 형태의 체세포 배를 대량 생산할 수 있는 조건을 구명하고, 생산된 체세포배를 종묘로 이용하기 위한 기초연구로 실시하였다. 배발생 캘러스를 생장조절제, 당, 질소원등을 농도별로 첨가한 MS배지에 현탁배양한 결과는 아래와 같다. 배발생 캘러스를 생장조절제가 첨가되지 않은 액체배지에 현탁배양하면 배발생 세포괴 및 체세포 배가 왕성하게 증식되었다. 구형단계의 배를 IBA와 NAA를 첨가한 배지에 현탁배양하면 배발생 세포괴의 증식과 함께 배의 발달도 진행됐으나, 2,4-D가 첨가된 배지에서 배양하면 배발생 세포괴 및 세포만 증식하고 배의 발달은 진행되지 많았다. 질소원의 종류에 따른 배발생 세포괴의 생장 발육상태에서 $\textrm{KNO}_3$와 $\textrm{NH}_4\textrm{NO}_3$가 각각 20mM 첨가되었을 때 가장 좋았다. 유아 발달에는 $\textrm{NH}_4\textrm{NO}_3$가, 유근발달에는 $\textrm{KNO}_3$가 효과적이었다. 구형단계의 배를 sucrose가 3-6 % 첨가된 배지에 배양하면 발육이 좋았다. 구형단계의 배를 ABA가 첨가되지 않은 배지에 배양하면 하배축의 이상신장 및 다배현상이 일어나지만 ABA가 $10\mu\textrm{M}$ 첨가된 배지에 배양하면 하배축의 길이가 단축되고 이차배 발생도 현저히 감소하였다. 고체배지에 배발생캘러스를 계속 배양하여 다양의 구형배를 얻을 수 있고 이들을 생장조절제가 첨가되지 않은 배지에서 배양하면 종자 유내 식물체와 유사한 유식물을 얻을 수 있었다.
DNA와 histone 단백질의 변형은 식물 발달에 상당히 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 식물 조직 배양 및 식물 발달 단계에서 methylation의 영향을 알아보고자 벼 종자로부터 캘러스 형성 및 식물체 재분화 단계에서 demethylation 물질인 5-azacytidine을 처리하여 유전자 발현 양상을 분석하였다. 식물체로의 재분화 능력이 있는 벼 배상체 캘러스는 5-azaC가 첨가된 H6A 배지에서는 형성되지 않았으며 갈색을 띠는 캘러스가 형성되었다. 또한 정상적인 캘러스를 5-azaC가 첨가된 MSRA 재분화 배지에서 배양했을 때도 대조구와는 달리 식물체 재분화는 이루어지지 않았다. 이러한 결과는 5-azaC가 정상적인 배상체 캘러스 및 shoot 분화에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타냈으며 따라서 DNA methylation이 식물 조직배양에서의 정상적인 세포 dedifferentiation과 differentiation에 필수 요인이라는 것을 알 수 있었다. 벼 캘러스 형성 및 재분화 과정 동안의 methylation 영향을 알아보고자 각 단계별로 5-azaC를 처리 후 $GeneFishig^{TM}$ DEG와 DNA chip을 사용하여 유전자 발현 양상을 분석하였다. Epigenetic regulation, 전자전달, 핵산대사, 스트레스 반응에 관여하는 일부 유전자들의 발현이 증가하거나 감소하는 것을 알 수 있었다. 발현 차이가 있는 일부 유전자를 클로닝하여 확인하였고 RT-PCR 및 northern 분석으로 각 단계에서의 발현 차이를 할인하였다.
국내 콩 품종의 기내 재생 효율을 개선하고자 국내 장려품종인 우람, 진품2호, 청자3호, 태광콩 품종의 기관형성 및 자엽 크기별 체세포배발생을 검토하였다. 식물체 조직절편 부위별 (자엽, 배축, 자엽+배축 절편) 신초 형성율을 조사한 결과, 자엽과 배축을 포함한 절편(자엽 + 배축)이 절편 당 분화된 신초수가 가장 많았다. 반면에 자엽 절편과 배축 절편에서는 신초가 형성되지 않았다. 배지 종류별로는 B5 배지보다 MS 배지에서 신초형성이 양호했으며, BA 2 ㎎/L 처리구가 TDZ 2 ㎎/L을 첨가한 배지보다 신초 형성율이 높았다. 공시한 4 가지 품종 중 태광콩이 BA 2 ㎎/L를 포함한 MS배지에서 신초형성율이 83.3%로 가장 높았다. 또한 체세포 배발생을 통한 캘러스 유도율을 조사하기 위하여 미성숙 자엽을 크기(S: 1∼2 ㎜, M: 3∼5 ㎜, L: 6∼8 ㎜) 별로 구분하여 배양한 결과, 4 가지 품종 모두 중간 크기(M, 3∼5 ㎜)에서 가장 높았으며, 태광콩이 65.8%로 가장 높은 캘러스 유도율을 보였다.
이탈리안 라이그래스의 최적 조직배양 조건을 확립하기 위하여 성숙종자로부터 최적 배발생 캘러스 유도조건 및 효율적인 식물체 재분화 체계를 확립하였다. 배발생 캘러스 유도시 첨가되는 auxin으로는 2,4-D가 가장 효율적이었으며, 5mg/L 2.4-D가 첨가된 MS배지에서 배발생 캘러스가 가장 높은 빈도로 유도되었다. 식물체 재분화는 배발생 캘러스를 1mg/L 2,4-D와 5mg/L BA가 첨가된 N6배지에서 배양했을 때 70%이상의 재분화율을 나타내었다. 기본배지의 종류에 따른 배양효율의 차이는 캘러스 유도에는 MS배지가, 식물체 재분화에는 N6배지가 효과적이었다. 배발생 캘러스의 형성율은 품종간에 큰 차이가 없었으나, 재분화 능력은 Jeanne 품종이 73%의 가장 높은 재분화율을 나타내어 품종간에 큰 차이를 나타내었다. 본 연구를 통하여 확립된 단기간 고효율 재분화 시스템은 분자육종을 통한 신품종 이탈리안 라이그래스의 개발에 유용하게 응용되어질 수 있을 것이다.
오차드그래스의 최적 조직배양조건을 확립하기 위하여 3가지 품종의 성숙종자로부터 배발생 캘러스 유도 및 식물체 재분화에 미치는 배지첨가물질의 영향을 조사하였다. 성숙종자로 부터 배발생 캘러스 유도시 첨가되는 생장조절 물질로는 3mg/L 2,4-D 또는 dicamba와 0.1mg/L BA를 혼용첨가했을 때가 단용첨가구에 비해 높은 배발생 캘러스 유도효율을 나타내었다. 품종별 식물체 재분화 효율은 'Roughrider'가 가장 높게 나타났으며, 'Frode'가 중간정도, 'Frontier'가 가장 낮은 효율을 나타내었다. 식물체 재분화배지에 항산화물질로서 10mg/L의 $AgNO_3$와 40mg/L의 cysteine을 첨가해준 결과 식물체 재분화율이 증가되었다. 본 연구를 통하여 확립된 오차드그래스의 효율적인 조직배양체계는 유전자 형질전환을 통한 신품종 오차드그래스 개발에 유용하게 응용되어질 수 있을 것이다.
토양에서 재배되고 있는 묘삼의 뿌리 표피조직에는 근모가 많이 발생하였으나, 배지내에서 생육한 인삼 재분화식물체의 뿌리세포는 표피조직에 근모가 거의 발생하지 않았다. Phytagel이 적게 첨가된 배지에서 자란 유식물체의 뿌리에는 근모가 거의 발생하지 않았으며 근중, 근경, 지근발달 등의 뿌리 발육상태도 미약하였으나, phytagel의 농도가 증가함에 따라 근모의 발달, 근중, 근경, 세근발달 등의 뿌리발육이 양호해지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 phytagel이 적은 배지에서 자란 유식물에서는 통도조직의 발달이 미약하였으나 phytagel이 높은 배지에서 자란 유식물에서는 통도조직의 발달이 아주 양호하였다.
Clonal propagation of high-value forest trees through somatic embryogenesis (SE) has the potential to rapidly capture the benefits of breeding or genetic engineering programs and to improve raw material uniformity and quality. A major barrier to the commercialization of this technology is the low quality of the resulting embryos. Several factors limit commercialization of SE for Corsican pine, including low initiation rates, low culture survival, culture decline causing low or no embryo production, and inability of somatic embryos to fully mature, resulting in low germination and reduced vigour of somatic seedlings. The objective was to develop a Corsican pine maturation medium that would produce cotyledonary embryos capable of germination. Treatments were arranged in a completely randomized design. Data were analyzed by analysis of variance, and significant differences between treatments determined by multiple range test at P=0.05. Corsican pine (Pinus nigra var. maritima) cultures were initiated on modified !P6 medium. Modifications of the same media were used for culture multiplication and maintenance. Embryogenic cultures were maintained on the same medium semi solidified with 2.5 g/l Gelrite. A maturation medium, capable of promoting the development of Corsican pine somatic embryos that can germinate, is a combination of iP6 modified salts, 2% maltose, 13% polyethylene glycol (PEG), 5 mg!l abscisic acid (ABA), and 2.5 g/l Gelrite. After initiation and once enough tissue developed they were grown in liquid medium. Embryogenic cell suspensions were established by adding 0.951.05 g of 10- to 14-day-old semisolid-grown embryogenic tissue to 9 ml of liquid maintenance media in a 250ml Erlenmeyer flask. Cultures were then incubated in the dark at 2022$^{\circ}$C and rotated at 120 rpm. After 2.53 months on maturation medium, somatic embryos were selected that exhibited normal embryo shape. Ten embryos were placed horizontally on 20 ml of either germination medium ($\frac{2}{1}$strength Murashige and Skoog (1962) salts with 2.5 g/l activated charcoal) or same medium with copper sulphate adjusted to 0.25 mg/1 to compensate for copper adsorption by activated carbon. 2% and 4% maltose was substituted by 7.5% and 13% PEG respectively to improve the yield of the embryos. Substitution of' maltose with PEG was clearly beneficial to embryo development. When 2% of the maltose was replaced with 7.5% PEG, many embryos developed to large bullet-shaped embryos. At latter stages of development most embryos callused and stopped development. A few short, barrel-shaped cotyledonary embryos formed that were covered by callus on the sides and base. When 4% of the maltose was removed and substituted with 13% PEG, the embryos developed further, emerging from the callus and increasing yield slightly. Microscopic examination of the cultures showed differing morphologies, varying from mostly single cells or clumps to well-formed somatic embryos that resembled early zygotic embryos only liquid cultures with organized early-stag. A procedure for converting and acclimating germinants to growth in soil and greenhouse conditions is also tested. Seedling conversion and growth were highly related to the quality of the germinant at the time of planting. Germinants with larger shoots, longer, straighter hypocotyls and longer roots performed best. When mature zygotic embryos germinate the root emerges, before or coincident with the shoot. In contrast, somatic embryos germinate in reverse sequence, with the cotyledons greening first, then shoot emergence and then, much later, if at all, the appearance of the root. Somatic seedlings, produced from the maturation medium, showed 100% survival when planted in a field setting. Somatic seedlings showed normal yearly growth relative to standard seedlings from natural seed.
Lee Jeong-Sun;Kim Chang-Kyun;Kim In-Sung;Lee Eun-Ju;Choi Hong-Keun
Journal of Plant Biotechnology
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제8권1호
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pp.21-25
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2006
Phragmites australis (reed) has received much attention as being one of the principle emergent aquatic plants for treating industrial and civil wastewater. Plant regeneration via plant tissue culture in p. australis was investigated. Three types of callus were identified from seeds on N6 medium plus 4.5 UM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Yellow compact type showed the best redifferentiation, whereas white compact type and yellow friable were not competent to differentiate into plane. Solid medium culture was better than liquid suspension culture for enhancing callus growth when N6 medium supplemented with 4.5 ${\mu}M$ 2,4-D was used. Phytagel, as a gelling agent, was superior to agar in plant regeneration on N6 medium, supplemented with 9.4 ${\mu}M$ kinetin and 0.54 ${\mu}M$$\alpha$-naphthaleneacetic acid (NAA). Transfer of the plantlets regenerated from kinetin and NAA-supplemented N6 medium to growth regulator-free MS medium enhanced the further development of the plantlets. Plantlets on subsequently grown to maturity when tansferred to potting soil. The regenerated plants exhibited morphologically normal. The system for plant regeneration of P. australis enables to propagate elite lines on a large scale for water purification in the ecosystem
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[게시일 2004년 10월 1일]
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